Medi��es de distribui��es de sinais ser�o feitas com fluoresc�ncia. Medi��es de permeabilidade de membrana s�o feitas com corrente el�trica. Nessas condi��es, os n�cleos fabricam DNA, RNA e mostram transporte macromolecular atrav�s dos NPCs. A prepara��o (n�cleo+meio) produz prote�nas (Bustamante et al., 2000a,b; Bustamante et al. + Bustamante & Dean, submetido). Usaremos o pDNA que codifica para a prote�na de fluoresc�ncia verde (pEGFP-C1). J� demonstramos que esse plasm�dio entra no n�cleo e produz mRNA que depois � usado na s�ntese de EGFP (enhanced green fluorescence protein). As vias de sinaliza��o s�o estudadas com dois grupos de sondas fluorescentes. O primeiro grupo usa a propriedade que a pEGFP entra no n�cleo e funciona corretamente. Baseado nisso, utilizamos plasm�dios da familia pEGFP (p.ex., pPKA-pEGFP, pPKC-pEGFP, pp53-pEGFP, pNFkB-pEGFP, pCREB-pEGFP, pCRE-pEGFP) que codificam para prote�nas de fus�o para sinais celulares (p.ex., PKA, PKC, p53, NFkB, CREB, CRE). O resultado � que as mol�culas de sinaliza��o produzidas est�o acompanhadas da EGFP e, por isso, � f�cil observar sua mobiliza��o quando as manobras experimentais s�o aplicadas (p.ex., radia��o UV, TNF, TPA). Uma outra sonda que usaremos � a ficoeritrina B (240 kD) conjugada ao sinal nuclear do SV40 (ver Bustamante et al., 1995a). Essa sonda � necess�ria para caraterizar o transporte de macromol�culas menores que os plasm�dios (p.ex., pEGFP tem 3,1 Megadaltons). O segundo grupo de sondas fluorescentes que usaremos est� baseado no conceito de que muitas mol�culas que entram no n�cleo ou saem dele somente sob a presen�a de Ca²⁺, ATP, e outros substratos. Por isso, monitoraremos [Ca²⁺] com sondas fluorescentes (p.ex., Alexa-Fluor da Molecular Probes) e tamb�m manipularemos [Ca²⁺] com seq�estradores de Ca²⁺, inibidores de bombas de Ca²⁺, etc. (Molecular Probes). Al�m disso, usaremos sondas fluorescentes inertes para inferir o di�metro dos poros (Bustamante et al., 2000b). Contamos com o equipamento de fluoresc�ncia (c�maras de CCD n�o intensificadas), mas n�o temos a sensibilidade para a resolu��o molecular que precisamos para poder correlacionar com precis�o as medi��es (de fluoresc�ncia e el�tricas) ao nivel de um �nico poro nuclear (p.ex., Bustamante et al., 2000a-b). As transloca��es macromoleculares atrav�s dos poros nucleares ser�o quantificadas por meio das estat�sticas padr�es (p.ex., Bustamante, 1992, 1993; Bustamante et al., 1995a-c). Nossa contribui��o neste campo � o desenvolvimento do paradigma do canal i�nico transportador de macromol�culas (ver publica��es citadas no come�o desse par�grafo). Brevemente, o que isso quer dizer � que cada vez que uma macromol�cula passa pelo poro, ela entope o mesmo. Como resultado, o fluxo de cargas el�tricas � interrompido e n�o � detectado valor algum de corrente el�trica atrav�s da membrana nuclear. A interpreta��o � que o entupimento do poro causa exclus�o dos �ons que s�o os condutores de carga el�trica. Manobras que aumentam a atividade e express�o dos genes devem aumentar a capacidade de transporte dos poros nucleares. Essa capacidade � medida com essas duas t�cnicas. A fluoresc�ncia dever� mostrar maior intensidade nos compartimentos finais de transporte. As medi��es el�tricas dever�o mostrar uma maior atividade de transporte macromolecular. Esses experimentos b�sicos ser�o conferidos em outras prepara��es pelos demais participantes.

Tr�s metodologias de nosso laborat�rio facilitam a realiza��o do subprojeto proposto (para ver equipamento dispon�vel, clique aqui). (1) N�cleos isolados com capacidade de transcri��o e TMM (Bustamante et al., 2000a-c). (2) Extrato celular (TTT) que fornece suficiente substratos para transcri��o, para TMM e para tradu��o (Bustamante et al., 2000b,c). (3) Sistema integrado de micromanipula��o e microscopia que possibilita registros de patch-clamp e fluoresc�ncia por v�rios dias (p.ex., Bustamante et al., 1995a-d; 2000a-c). Esses logros permitem duas coisas antes imposs�veis. (1) Patch-clamp direto do n�cleo funcional. Antes de nossa contribui��o, a prepara��o mais usada para o estudo de TMM era a c�lula permeabilizada (o qual impede a coloca��o da pipeta de patch-clamp sobre o envolt�rio nuclear). (2) A microscopia de fluoresc�ncia simult�nea ao patch-clamp. Em nosso laborat�rio � poss�vel estudar a atividade de canal i�nico do complexo do poro nuclear (NPC - nuclear pore complex) simultaneamente ao monitoramento de fatores/prote�nas de sinaliza��o celular j� que podemos expressar eles fusionados com membros da fam�lia da prote�na de fluoresc�ncia verde aumentada, EGFP. Isso � realizado simplesmente adicionando ao TTT, o pDNA que codifica para EGFP (pEGFP, ver Bustamante et al., 2000a-c) sem necessidade de estar fusionada com um sinal de localiza��o nuclear (NLS - nuclear localization signal). Como mostramos (Bustamante et al., 2000a-c), � suficiente para pEGFP possuir uma seq��ncia � que estejam ligados fatores de transcri��o. Em 1995 (Bustamante et al., 1995a-d) introduzimos o conceito que no n�cleo celular TMM pode ser detectado com patch-clamp usando o principio do molecular Coulter counter (MCC) para contar pol�meros com nanocanais (Bezrukov et al., 1994; ver revis�o de Bezrukov, 2000). Pouco depois, Kasianowicz et al. (1996) e Szab� et al. (1997, 1998) demonstraram o uso do MCC na detec��o da transloca��o de DNA atrav�s de canais da membrana mitocondrial (ver B�thori et al., 1998). Um dos alvos espec�ficos de nossa proposta � a quantifica��o dos par�metros/fatores que determinam a transloca��o de DNA com voltagem em n�cleos funcionais. Para isso, usaremos pEGFP-C1 (que possui a seq��ncia enhancer SV40 � que os fatores de transcri��o se unem) marcado com a sonda fluorescente vermelha rodamina (pEGFP-C1-Rod), produzida usando a metodologia chamada de pin�a pept�dio-�cido nucl�ico (peptide nucleic acid, PNA, clamp � p.ex., Branden et al., 1999; Wilson et al., 1999; Zelphati et al. 1999). A pin�a n�o modifica a conforma��o do pEGFP-C1 ou sua habilidade de ser eficientemente expressa (p.ex., Wilson et al., 1999). Dessa maneira, poderemos observar a cin�tica de transfec��o com o microsc�pio de fluoresc�ncia e associar essa observa��o com os par�metros de patch-clamp (condut�ncia, constantes de tempo de entupimento e desentupimento, tempo de entupimento/transloca��o, probabilidades de abertura e fechamento do canal, etc.). Essa contribui��o � de grande utilidade na prepara��o de novas metodologias para terapia g�nica, para melhoramento gen�tico de estoques agropecu�rios e para outros usos que realmente ainda hoje pertencem � fic��o cient�fica. Mais detalhes podem ser encontrados na homepage do laborat�rio.

Propomos realizar estudos de sinais de grande import�ncia para as doen�as supracitadas: NFkB, p53, CREB, PKA, PKC, etc. Seguindo a nossa metodologia (p.ex., Bustamante et al., 2000a,b - reprints aqui), incorporaremos plasm�dios de DNA (pDNA) em n�cleos de c�lulas do sistema imune (p.ex., linf�citos), do sistema cardiovascular, de c�ncer. Esses pDNAs codificam para esses sinais mas eles est�o fusionados com membros da fam�lia da prote�na de fluoresc�ncia verde (EGFP: enhanced green fluorescence protein). Assim, o plasm�dio pNFkB-pEGFP produzir� a prote�na NFkB-EGFP que j� demonstramos pode ser monitorada com microscopia de fluoresc�ncia em nossos n�cleos (Bustamante et al., 2000a,b). Ca²⁺ ser� monitorado diretamente com sondas fluorescentes convencionais e manipulado com seq�estradores de Ca²⁺ que podem ser manipulados com pulsos de nosso laser de luz UV (ver Molecular Probes). Enquanto monitoramos as distribui��es e transloca��es atrav�s do poro desses sinais, medimos os pulsos (picos e vales) de corrente el�trica atrav�s de um �nico poro nuclear (correspondentes a transloca��es macromoleculares). Utilizaremos v�rios protocolos para estimular as diferentes cascatas de sinaliza��o celular mencionadas. Por exemplo, adicionamento de cAMP estimula a PKA. Radia��o cont�nua com UV estimula NFkB e p53.

Esse aspecto da metodologia � de extrema import�ncia e trataremos de dar tanta informa��o como seja poss�vel dentro do espa�o limitado. Os n�cleos ser�o isolados com nossas t�cnicas (p.ex., Bustamante, 1992, 1993, 1994a,b; Bustamante et al., 1995a-c, 2000a,b). Brevemente, o camundongo (Swiss-Webster, 20-22 g, macho) � decapitado e seu cora��o (e/ou outro �rg�o a ser estudado) extra�do rapidamente e colocado por 5 min numa solu��o salina (mM: 150 NaCl, 10 Hepes, 5 KOH, 2 CaCl₂, 5 MgCl₂; pH 7,3-7,4). Essa solu��o facilita a elimina��o de sangue do cora��o j� que a solu��o usada cont�m Ca²⁺ que mant�m os batimentos card�acos. Depois desse per�odo, o cora��o � colocado numa solu��o salina a 4 ^oC. A segunda solu��o consiste em (mM): 150 KCl, 10 Hepes, 5 KOH, 5 MgCl₂; pH 7,2-7,3. Nessas condi��es, o cora��o para de bater, facilitando assim a dissec��o de precis�o (como � feito na cirurgia do cora��o com solu��es cardiopl�gicas) com tesouras Duracut de tungst�nio-carborundo. Os ventr�culos s�o selecionados para processamento porque eles apresentam a maior massa do miocardio. Eles s�o cortados em peda�os de 2-3 mm³, lavados com a �ltima solu��o (3 lavagens), e colocados num triturador de tecido (Dounce). O tecido ent�o � triturado delicadamente. A mistura produzida � filtrada usando uma seq��ncia de filtros de teflon (100, 50, 25 e 10 mm). O filtrado � usado para produzir o extrato celular, TTT, que fornece todos os substratos para a transcri��o, o transporte macromolecular, e a tradu��o. Para isso, usamos um filtro est�ril de 0,2 mm. Os n�cleos em TTT s�o colocados numa c�mara de perfus�o de 100 ml de volume. Antes do uso, a c�mara experimental � esterilizada com �lcool e exposta a luz UV durante a noite. Nessas condi��es, quando incubados com TTT e pEGFP-C1, os n�cleos de cardiomi�citos expressam a prote�na fluorescente verde EGFP (ver Bustamante et al., 2000a-c). Eles mant�m suas propriedades por at� 3 dias. No terceiro dia, a contamina��o ambiental � evidente pela presen�a de bact�rias no campo visual do microsc�pio. Ou seja, o experimento � interrompido n�o por falha do patch-clamp (i.e., perda do gigaseal) ou por falha do n�cleo o do TTT (que � perfundido lentamente), mas pela contamina��o por bact�rias da prepara��o.

Controle. O comportamento de canal do NPC � probabil�stico e similar ao do spin dos el�trons (p.ex., Bustamante, 1992). Em estado estacion�rio, as probabilidades de abertura e fechamento s�o quase iguais (i.e. 0,5 � ver Bustamante, 1992). Por isso, geramos conjuntos ou ensembles de registos de corrente de patch. Desses ensembles, estimamos as caracter�sticas estat�sticas da popula��o de canais e de cada canal individual. Como toda an�lise estat�stica, com maior n�mero de amostras, melhor estimativa estat�stica. Infelizmente, temos duas limita��es. A primeira � que as propriedades podem mudar durante minutos. A segunda � a quantidade finita de disco r�gido do computador (p.ex., cada registro ou tra�o de corrente requer 4 kB). Felizmente, durante a d�cada passada, encontramos que gerando um ensemble de 8 registros de corrente, � poss�vel analisar adequadamente os eventos carater�sticos dos poros no patch do envolt�rio. Caso as propriedades n�o mudem em minutos, os ensembles podem ser agrupados. Esses ensembles podem ser gerados de duas maneiras: ou por 8 pulsos de voltagem ou por 8 amostras iguais durante a aplica��o de uma voltagem constante. Por exemplo, podemos aplicar 8 pulsos de +50 mV (a partir do n�vel basal de 0 mV) e 2 s; ou podemos aplicar +50 mV e tomar 8 amostras de 2 s. Nos dois casos, devemos dar um intervalo suficiente entre cada pulso ou amostra para gravar no disco r�gido (perto de 300 ms). A vantagem do segundo m�todo � que o artefato de corrente capacitiva (I_C, causado pela varia��o brusca da voltagem no come�o do pulso: I_C=-C(dV/dt), com C sendo a capacit�ncia da membrana) pode causar confus�o para aqueles que n�o est�o acostumados ao patch-clamp (i.e., nunca causam interpreta��o err�nea para o conhecedor de patch-clamp). Outra forma � compensar I_C. Mas isso � necess�rio e � feito para correntes muito r�pidas (como I_Na, que podem ser simult�neas a I_C) e n�o � preciso com as correntes lentas do poro nuclear (vis � vis as correntes de Na⁺ - ver Bustamante & McDonald, 1983). Uma vez gerados os ensembles de correntes com o software Clampex de pClamp, eles s�o processados com Fetchan e pStat de pClamp. Os par�metros extra�dos de inspe��o direta e de histogramas de amplitude e de tempo s�o: condut�ncia i�nica de um canal, g, probabilidade de abertura, p_o, tempo de abertura, T_o, inativa��o versus voltagem (ver Bustamante, 1992), etc. Todos esses par�metros s�o t�picos da an�lise de patch-clamp (p.ex., Bustamante, 1992, 1993, 1994a). Tamb�m pode ser extra�da informa��o sobre a popula��o dos poros que conduzem �ons. Por exemplo, podemos saber a condut�ncia m�dia do patch, G , o n�mero de canais que conduzem �ons no patch, N, a probabilidade de abertura da popula��o, P_o, se os canais s�o independentes ou n�o (p.ex., se eles podem ser modelados com a distribui��o normal � ver Bustamante, 1992), etc. E tamb�m podemos analisar se o patch apresenta o fen�meno de inativa��o, reportado por primeira vez para mi�citos card�acos (Bustamante, 1992). Mas, note com �nfase, que, diferentemente da an�lise cl�ssica, caraterizaremos quantitativamente o fen�meno, recentemente reconhecido, de entupimento e desentupimento. Este efeito foi observado no poro com patch-clamp e reportado pela primeira vez em mi�citos card�acos (p.ex., Bustamante, 1994b; Bustamante et al., 1995a). O fen�meno � muito interessante porque no come�o do entupimento, a corrente atrav�s do canal do NPC (e da� condut�ncia, g, j� que a voltagem � constante) declina exponencialmente para zero (Bustamante et al., 1995a). O desentupimento do canal � identificado pela volta exponencial da corrente (e g) ao valor original (Bustamante et al., 1995a). Essas observa��es foram confirmadas para o DNA por Kasianowicz et al. (1996) e Szab� et al. (1997) em canais i�nicos de mitoc�ndria.

Efeito de voltagem. O crescente reconhecimento de que a voltagem influencia a transloca��o de DNA (p.ex., Szab� et al., 1997; Han & Craighead, 1999) sugere que nossa identifica��o da inativa��o induzida pela voltagem (Bustamante, 1992) pode ser indica��o do entupimento do canal por macromol�culas que s�o for�adas para dentro do canal com o incremento do campo el�trico atrav�s do poro quando � aplicada uma voltagem (similar ao modelo de ball-and-chain para o canal cl�ssico de Na⁺). Essa pode ser uma quantifica��o de import�ncia para biotecnologia de clonagem pois ela utiliza pulsos el�tricos para iniciar a atividade nuclear uma vez que a transfer�ncia nuclear � conclu�da. Finalmente, a polaridade dos pulsos � importante. Diferentemente dos procedimentos usados pelos poucos laborat�rios que trabalham neste campo, nosso procedimento experimental � o de alternar a polaridade da voltagem para reduzir os efeitos de uma ou outra polaridade (p.ex., Bustamante, 1992; Bustamante et al., 1995a, 2000a-c). Szab� et al. (1997) demonstraram que como o DNA � eletricamente negativo, ele vai deslocar-se no campo el�trico segundo a polaridade do mesmo. Como � sabido, as cargas el�tricas positivas se deslocam ao longo das linhas de for�a do campo el�trico. Essas linhas v�o da maior a menor voltagem. Assim, a voltagem negativa da pipeta ajudar� a transfec��o. Que a transloca��o de macromol�culas � suscept�vel ao campo el�trico tamb�m foi demonstrado por Bezrukov & Kasianowicz (1997).

Equa��es b�sicas. Realizaremos inicialmente um tratamento unidimensional. � importante para estabelecer a din�mica de transloca��o, estabelecer a rela��o entre a for�a do campo el�trico, F, e a velocidade de transloca��o, v. Ou seja, aplicaremos uma segunda lei de Newton geral: F=d(mv)/dt=m(dv/dt)=ma= md²s/dt². Onde m � a massa do DNA que assumimos constante (p.ex., � 3,1 megadaltons no caso de pEGFP), v=ds/dt (sendo s o deslocamento unidimensional), dv/dt � a derivada com respeito ao tempo, t - ou seja, a acelera��o, a. Esta for�a �, na realidade, o resultado de varias for�as agindo sobre o DNA. A for�a propulsora do campo el�trico (carga vezes campo: qE - a sua vez uma for�a resultante da intera��o de varias for�as), a for�a de fric��o causada pela intera��o do DNA com as paredes interiores do canal do poro (-hv � sendo h o tensor de fric��o/atrito mas aqui uma quantidade escalar), e uma for�a qu�mica derivada das rea��es hidrol�ticas que produzem a energia a partir do ATP, GTP, etc. (a ser identificada com o uso de an�logos n�o hidrolisantes � p.ex., ATP-g-S e GTP-g-S). Os par�metros desses componentes ser�o identificados em nosso subprojeto. Devemos notar que o problema foi apresentado de forma simplificada. Na realidade, o processo de transloca��o pode ser descontinuo e tortuoso. Isto � devido ao fato da mol�cula de DNA ser muito longa. Por isso, a mol�cula n�o estar� totalmente dentro do poro o tempo todo. Ao inv�s, parte dela estar� dentro e parte fora. Consequentemente, � poss�vel que tanto a massa, m, como a carga el�trica, q, variem durante a transloca��o. Por�m, nosso primeiro objetivo � testar a hip�tese de se a primeira aproxima��o (i.e., de primeira ordem) matem�tica � poss�vel. Da�, realizaremos as modifica��es necess�rias. Outras equa��es poder�o ser desenvolvidas para outros aspectos do NPC. Por exemplo, discutimos o assunto da condut�ncia do NPC. Esse pode ser analisado por m�todos n�o tradicionais (i.e., n�o Nernst-Planck). Recomendamos ao leitor visitar o trabalho de Salman et al. (2001).

Temos todos os equipamentos para este estudo (ver Contrapartida) exceto a c�mera para a detec��o e an�lise dos sinais fluorescentes (que � necess�ria para realizar uma correla��o ao n�vel de mol�culas �nicas - mas n�o impede a realiza��o de muitos aspectos dos subprojeto). Financiamento para a compra da c�mera � solicitado no or�amento. A c�mera � um CCD intensificado para alta sensibilidade � luz e garantida a realizar o trabalho proposto (US$36.000 - I-PentaMax-Gen IV, Princeton Instrum. � companhia que agora forma parte do conglomerado Roper Scientific � distribu�da por Axon Instrum.). Esse instrumento permite detectar as mol�culas individuais de DNA. Usaremos filtros/cubos dicr�icos para a fam�lia EGFP (Omega Optical � temos). Como fonte de ilumina��o usaremos nossa fonte estabilizada Oriel (Bustamante et al., 2000a-c). A I-PentaMax-Gen IV (com resolu��o m�xima de 512 x 512 pixels � suficiente para nosso estudo) est� conectada a um sistema de aquisi��o de dados de imagens (placa PCI + computador) sob o comando do software Imaging Workbench (US$4.000 - Axon � pedido tamb�m nesta proposta). Temos o computador para aquisi��o e processamento de imagens (Pentium II-400 MHz, 128 MB RAM, 15 GB HD, monitor 107S Philips 17" , resolu��o de 1248x1024). Um dos fatores que quantificaremos � a concentra��o de Ca²⁺ ([Ca²⁺]) na cisterna do envolt�rio nuclear, [Ca²⁺] no interior do n�cleo, e [Ca²⁺] no exterior do n�cleo. Sabemos hoje que gradientes nucleocitoplasm�ticos de [Ca²⁺] podem ser estabelecidos (revisado em Badminton et al., 1998). Ou seja, os sinais de [Ca²⁺] s�o verdadeiros e, por isso, importantes para a fun��o dos genes. Uma vez calibrado o sistema com o tamp�o de calibra��o de [Ca²⁺], os valores de [Ca²⁺] ser�o quantificados usando a sonda fluorescente Oregon Green 488 BAPTA-1 e BAPTA-2 (Molecular Probes). Como a sonda n�o entra na cisterna do envolt�rio, a forma salina dessas sondas servir�o para quantificar [Ca²⁺] nos compartimentos intra- e extra-nucleares. Para medir [Ca²⁺] na cisterna, precisamos da forma AM da sonda, que � perme�vel e que j� demonstramos poder ser convertida pelas esterases da cisterna de nossos n�cleos (Bustamante et al., 2000a). Como o valor de [Ca²⁺] pode atingir at� a ordem de mM, usaremos tamb�m Rhod-5N (Molecular Probes), sonda que tem uma constante de associa��o-dissocia��o bastante maior. Al�m disso, � poss�vel manipular a [Ca²⁺] da cisterna, com diazo-2 e 3 (Molecular Probes). [Nota: Solicitamos somente diazo-2 para ficar dentro do limite do or�amento permitido. Financiaremos internamente a compra de diazo-3]. Essa � uma sonda que pode seq�estrar o Ca²⁺ uma vez iluminada com UV. Para esse fim usaremos nosso laser de pulso UV (3 ns, 337 nm - VSL-337 LaserScience � laser � plasma de nitrog�nio) que � atenuado com filtro neutro (Oriel) devido a sua alta energia (120 mJ), pot�ncia pico (3 kW ) e pot�ncia m�dia de 3 mW. O laser � acoplado � objetiva atrav�s de uma fibra �ptica (Oriel). Nossos estudos preliminares (ainda n�o publicados), demonstram que nossa prepara��o (n�cleos + TTT) apresenta envolt�rio nuclear com conte�do de Ca²⁺ entre 0,5 e 2 mM (dependendo das condi��es).

Efeito de Ca²⁺. Como indicamos, alteraremos [Ca²⁺] fora e dentro da cisterna do envolt�rio nuclear para determinar os efeitos sobre a transloca��o controle de DNA. A altera��o fora da cisterna � feita simplesmente variando a concentra��o extranuclear. A altera��o dentro da cisterna � feita de duas formas. (1) Com diazo-AM encaixotado (Mol Probes) que � colocado dentro da cisterna. O diazo � um scavenger de Ca²⁺. Assim, quando liberado por pulso de raio UV (dados com nosso laser de pulso UV de 3 nanosegundos), [Ca²⁺] diminui. A curta dura��o do pulso permite a redu��o calibrada de [Ca²⁺] com diazo. (2) Com cADP-ribose-encaixotada (Mol Probes) colocada no banho do n�cleo. O cADP-ribose � um dos est�mulos mais fortes para a libera��o de Ca²⁺ da cisterna. Assim, quando liberado o estimulante, [Ca²⁺] diminui. Esperamos uma resposta incremental da TE com satura��o. Ou seja, o Ca²⁺ ajudar� a transloca��o de pDNA de uma forma matem�tica direta. Em correspond�ncia ao demonstrado recentemente por n�s (Bustamante et al., 2000a), antecipamos que o Ca²⁺ fora da cisterna tenha efeito indireto. Isto �, atrav�s de seu efeito de fonte de fornecimento de Ca²⁺ na cisterna j� que ele � usado pelas bombas de Ca²⁺ nas duas membranas do envolt�rio para recuperar o n�vel normal de Ca²⁺ na cisterna.

Transfec��o vs. Sistemas de Sinaliza��o Celular: CREB, PKC, IkB, NFkB, p53, GRE, etc. Uma vez identificada a mec�nica de transfec��o do pEGFP-C1-Rod, e os efeitos de Ca²⁺, nosso alvo ser� a rela��o entre a transfec��o e a express�o de diversos componentes de sinaliza��o celular. Isto, de certa forma, est� relacionado com a efici�ncia da transfec��o j� que n�o somente � importante para o pDNA entrar no n�cleo, mas tamb�m realizar sua fun��o de express�o da prote�na correspondente (mas primeiro atrav�s da s�ntese de mRNA). Nossa experi�ncia com os plasm�dios de EGFP da Clontech mostra que � poss�vel obter informa��o �til para publica��o e patente. Como explicamos na justificativa do or�amento, a Clontech vende plasm�dios codificando para membros da fam�lia da EGFP fusionados com v�rias prote�nas de v�rias cascatas de sinaliza��o celular. Ampla informa��o � dada pela Clontech. Por isso, usaremos esses plasm�dios para monitorar as vias de sinaliza��o celular. Com exce��o do plasm�dio pEGFP-C1-Rod (que j� temos e foi testado com �xito pelo nosso colaborador Dr. David A. Dean, ver Bustamante et al., 2000a-c), precisamos dos demais plasm�dios a serem usado no subprojeto. Eles s�o usados tanto para a determina��o da cin�tica de transloca��o de DNA (e RNA) e express�o de prote�nas que servem para monitorar alguns dos fatores que participam da transloca��o ou que s�o afetados pela transloca��o e express�o. Os plasm�dios que estamos incluindo s�o aqueles da Clontech, linha Mercury. Informa��o � dispon�vel sobre os plasm�dios Mercury

O plasm�dio � desenhado especialmente para monitorar a ativa��o da via de tradu��o da prote�na CREB e os caminhos de sinaliza��o do cAMP associados com o elemento g�nico de resposta a cAMP (CRE), incluindo a quinase de terminal N Jun (JNK) p38 MAPK, e quinase A (PKA) (ver o website). A ativa��o desses caminhos permite a liga��o de fatores de transcri��o como CREB ou ATF a CRE, ativando assim a transcri��o do gene reporter. O d2EGFP � uma variante destabilizada de EGFP. A diferen�a da prote�na original EGFP, que � extremamente est�vel, d2EGFP tem uma vida m�dia de 2 horas in vivo. Por isso, ela fornece uma medida mais precisa da ativa��o transiente por NFkB que a EGFP original e � ideal para estudos da cin�tica de ativa��o g�nica. A import�ncia das quinases foi indicada em nosso trabalho inicial (Bustamante, 1992). Essa observa��o � agora refor�ada pela recente publica��o do laborat�rio de Larry Gerace usando c�lulas permeabilizadas e t�cnicas tradicionais, n�o el�tricas (Kehlenback & Gerace, 2000). Quando CRE-d2EGFP � fosforilada, a fluoresc�ncia de EGFP aumenta. Dado que cAMP � um importante segundo mensageiro, � evidente que as observa��es feitas ser�o muito relevantes �s cascatas de sinaliza��o de cAMP e atividade gen�tica regulada por CREB e CRE.

Esse plasm�dio � importante para determinar a movimenta��o de PKC (e, indiretamente, Ca²⁺) com as diversas manobras que usaremos (estresse de calor ou heat shock, frio, UV, etc.). � sabido que depois de 3 min de tratamento das c�lulas com PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) PKCg transloca-se para o n�cleo (ver web site). PKC, que tem um papel muito importante no TMM e na mobiliza��o de lip�dios no n�cleo ser� estudada com a prote�na de fus�o PKC-EGFP expressa depois da incuba��o com pPKCg-EGFP. Note que existe outro plasmidio para PKC: pPKCb-EGFP. Esse n�o ser� usado j� que n�o migra para o n�cleo. PKCg-EGFP transloca-se para o n�cleo uma vez que a c�lula � estimulada com PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate). As observa��es com PKC ser�o muito importantes para cascatas de sinaliza��o relacionadas a esse fator.

Plasm�dio pIkB-EGFP (6919-1) � Sinaliza��o IkB/NFkB

O plasm�dio � importante porque ele possibilita o estudo da movimenta��o de IkB (inhibitor ou inactivator of kappa B) e, da�, a transloca��o de NFkB (nuclear factor kappa B). Esse complexo, IkB/NFkB, e cada um de seus componentes, � sumamente importante nos mecanismos de prote��o ao estresse e do sistema imune, e por isso, para entender os processos das doen�as do sistema imune (incluindo AIDS). O estudo de IkB (e NFkB), tamb�m serve para entender um dos mecanismos de entrada no n�cleo. Em estado quiescente, IkB e NFkB est�o ligados no citoplasma. Por isso, o NFkB (que � necess�rio para ativar a resposta imune e de resist�ncia ao estresse) n�o consegue passar atrav�s do poro nuclear. A fosforila��o de IkB (ele � composto de duas subunidades), libera o NFkB, fazendo poss�vel sua transloca��o para o interior do n�cleo (atrav�s do poro nuclear). Essa rea��o � bastante complicada e depende de v�rios fatores, incluindo IKK (a quinase que ativa IkB). A movimenta��o de IkB, e portanto de NFkB, ser� determinada com o plasm�dio pIkB-EGFP j� que � conhecido que a fosforila��o (degrada��o) de IkB resulta numa redu��o da fluoresc�ncia da prote�na de fus�o IkB-EGFP (ver Clontech). Os resultados com esse plasm�dio s�o relevantes ao sistema imune. Ver tamb�m o pr�ximo par�grafo.

Plasm�dio pNFkB-d2EGFP (6054-1) � Sinaliza��o de IkB/NFkB

O plasm�dio � desenhado especialmente para monitorar a ativa��o da via de tradu��o de NFkB (ver o website). A ativa��o da via permite a liga��o do NFkB endog�nio ao elemento enhancer KB₄ na regi�o promotora do vector, ativando assim a transcri��o do gene reporter. Como explicado para o caso anterior de CRE-d2EGP, a vida m�dia de d2EGFP � de 2 horas. Por isso, ela fornece uma medida mais precisa da ativa��o transiente por NFkB que a EGFP original e � ideal para estudos da cin�tica de ativa��o g�nica. NFkB � relevante ao sistema imune. Por isso, informa��o obtida ser� importante.

Plasm�dio pp53-EGFP (6920-1) � Sinaliza��o de p53

Esse plasm�dio � importante porque ele produz a prote�na de fus�o p53-EGFP, que serve para monitorar p53, um supressor de tumor e controla o ciclo celular. Ele, como outros fatores (e.g., NFkB), s�o mobilizados nos casos de estresse celular. O p53 � sumamente importante para entender alguns processos cancerosos. A sonda fluorescente � expressa constitutivamente e reside no n�cleo mas quando estimulada a produ��o de p53 por est�mulos que causam dano de DNA, � detectado um aumento da fluoresc�ncia a causa do aumento em concentra��o da sonda. O fator p53 desempenha um papel importante no desenvolvimento de c�ncer. Por isso, os dados obtidos ser�o de relev�ncia no campo da medicina e sa�de.

Plasm�dio pGRE-d2EGFP (6033-1) � Sinaliza��o de Glicocortic�ides

O plasm�dio � desenhado especialmente para monitorar a ativa��o do elemento de resposta a glicocortic�ides (ver o website) e a ativa��o do caminho de sinaliza��o mediado pelos glicocortic�ides. Essa sonda fornece uma medida mais precisa da ativa��o transiente que a EGFP original e � ideal para estudos da cin�tica de ativa��o g�nica. Os glicocortic�ides tem um papel muito importante na resposta imune e movimentam muitos grupos de nutrientes no organismo: glicose, prote�nas e gorduras. Da� a import�ncia das observa��es.

9.3 . Estrat�gias adicionais

9.3.1 Movimenta��o dos sinais monitorados

Usaremos est�mulos que s�o conhecidos por sua influ�ncia sobre os sinais monitorados: choque t�rmico, radia��o UV, ativa��o e inibi��o de quinases (financiamento interno para n�o ultrapassar limite do or�amento) que influem diretamente as cascatas de sinaliza��o, etc. Devido �s limita��es financeiras, estamos procurando por algumas subst�ncias que possamos usar. Assim como for poss�vel, usaremos outras subst�ncias n�o mencionadas nesta descri��o.

9.3.2 Equa��es b�sicas

Mencionamos que a transloca��o e que, a resultante altera��o dos n�veis de concentra��o ser�o analisados inicialmente com aproxima��o de primeira ordem. Modelos mais complexos poder�o ser desenvolvidos ulteriormente. A movimenta��o dos fatores de sinaliza��o poder� apresentar complica��es em sua modelagem. Por isso, � dif�cil antecipar o modelo espec�fico que pode ser usado para tal prop�sito.

Refer�ncias escolhidas sobre NPCs, NE, e n�cleo celular

Microscopia de fluoresc�ncia mostrando pouco gradiente nucleocitoplasm�tico de concentra��o ionica

Giovannardi et al., 1994; O'Malley, 1994; Meyer et al., 1995; Stehno-Bittel et al., 1995b; Gerasimenko et al., 1996; Brown et al., 1997; Genka et al., 1999

Microscopia de fluoresc�ncia mostrando alto gradiente nucleocitoplasm�tico de concentra��o ionica.

Hern�ndez-Cruz et al., 1990; Al-Mohanna et al., 1994; Himpens et al., 1994a, 1994b; Gerasimenko et al., 1995, 1996; Bkaily et al., 1996; Kono et al., 1996; Tanaka et al., 1996; Lui et al., 1998a, 1998b; Pauly et al., 2000; Genka et al., 2000; Abrenica & Gilchrist, 2000

Microscopia de luminisc�ncia mostrando pouco gradiente ionico

Brini et al., 1994, 1996

Microscopia de luminisc�ncia mostrando alto gradiente i�nico

Badminton et al., 1995, 1996, 1998

O Tamp�o do NPC e sua rela��o com ATP e Ca²⁺ da cisterna do NE

Greber & Gerace, 1995; Perez-Terzic et al., 1996, 1997; Oberleithner, 1999; Rakowska et al., 1998; Str�bing & Clapham, 1999 (separata aqui); Stoffler et al., 1999 (clique com o bot�o da direita aqui para acessar a publica��o; Perez-Terzic et al., 1999; Keminer & Peters, 1999; Wang & Clapham, 1999; Bustamante et al., 1999; Ribbeck & Gorlich, 2001

Bloqueio do Canal i�nico pelo anticorpo monoclonal mAb414 ao NPC

Bustamante et al., 1995a; Prat & Cantiello, 1996

O Mito dos Canais Perif�ricos ao Canal Central do NPC

Um laborat�rio de EM publicou uma reconstru��o 3D do NPC que sugere a exist�ncia de 8 canais difusionais que s�o perif�ricos ao canal central do NPC (Hinshaw et al., 1992). Essas observa��es ainda n�o foram confirmadas. Nosso colega Mazzanti elaborou uma hip�tese que inclu� esses canais ou similares (Mazzanti, 1998). Essa id�ia foi contemplada por outros colegas Danker et al. (1999) para poder explicar as observa��es indiretas com um m�todo antigo para medir corrente atrav�s do n�cleo (revisado em Danker & Oberleithner, 2000). Infelizmente, esses pesquisadores n�o demonstraram a gigaseal na prepara��o (condi��o essencial para patch-clamp). Essa id�ia pode obter apoio com sondas fluorescentes. Por�m, estudos de microscopia de fluoresc�ncia demonstraram recentemente que esses canais n�o existem Keminer & Peters, 1999. Argumentos eletrofisiol�gicos j� foram publicados (Bustamante & Varanda, 1998). Experimentos de biologia celular demonstrando o papel dos NPCs como barreira foram publicados (Ribbeck & Gorlich, 2001). Para mais informa��o sobre o t�pico, por favor, clique Q&A's.

Canais Sens�veis ao IP₃ e � Rianodina

Mak & Foskett, 1994; Stehno-Bittel et al., 1995a; Guihard et al., 1997; Mak et al., 1999

Nota 1: Receptores de IP₃ foram observados somente na membrana interna da NE (p.ex., Humbert et al., 1996).

Nota 2: A heparina, usada para identificar canais operados por IP₃, estabiliza o tamp�o do NPC (p.ex., Strambio-de-Castillia et al., 1995), solubiliza a cromatina (p.ex., Bornens, 1973, 1977) e alter canais i�nicos (p.ex., Knaus et al., 1990; Lacinova et al., 1993; Hall et al., 1996; Krasilnikov et al., 1999; Sinnarajah et al., 1999). Para uma revis�o recente de essa sinaliza��o nuclear, veja Irvine, 2000 .

E, enquanto estamos vendo isso... vejamos id�ias fascinantes sobre a contamina��o do NE pelo ER

Danker et al., 1997

Canais de NE que podem ser NPCs, podem estar relacionados aos NPCs ou conectados aos NPCs

Matzke et al., 1990, 1992; Mazzanti et al., 1990, 1991, 1994; Innocenti & Mazzanti, 1993; Tabares et al., 1991; Maruyama et al., 1995; Rousseau et al., 1996; Draguhn et al., 1997; Longin et al., 1997; Tonini et al., 1999

Canais de NE Diferentes aos NPCs

Valenzuela et al., 1997, 2000; Tonini et al., 2000; Franco-Obregon et al., 2000; Guihard et al., 2000

Medi��o do Di�metro do NPC com Patch-Clamp

Bustamante et al., 2000

Medi��o El�trica do Di�metro de Outros Canais

Cecchi et al., 1982; Krasilnikov et al., 1992; 1995; 1996; 1998a; 1998b; Sabirov et al., 1992; Vodyanoy & Bezrukov, 1992; Carneiro et al., 1997; Cruickshank et al., 1997; Ternovsky et al., 1997; Merzlyak et al., 1999

Miosina e Actina como Mecanismos de Gating do NPC

Tonini et al., 1999 desenvolveram a id�ia de que o gating do NPC est� determinado pela miosina e actina e que essas mol�culas est�o diretamente reguladas por ATP e Ca²⁺. Nossos resultados apontam numa dire��o diferente e sugerem que tanto ATP como Ca²⁺ agem indiretamente, atrav�s da cisterna do envolt�rio nuclear, NE. Acreditamos que a transloca��o macromolecular explica e unifica todas as observa��es experimentais (Bustamante, 1994b; Bustamante et al., 1994c; Bustamante et al., 1995a; Bustamante & Varanda, 1998; Bustamante et al., 1999).

Microeletrodos

Loewenstein & Kanno, 1962 (Nature 195:462), 1963 (J. Cell Biol. 16:421, J Gen Physiol 46:1123); Kanno & Loewenstein, 1963 (Exptl. Cell Res. 31:149); Ito & Loewenstein, 1965; Kanno et al., 1965; Wiener et al., 1966; Kislov & Veprintsev, 1970, 1971; Turkevich, 1970; Starodubov & Kurella, 1972; Giulian & Diacumakos, 1977; Reynolds & Tedeschi, 1984

Estrutura do NPC

Hinshaw et al., 1992; Akey & Radermacher, 1993; Pant� & Aebi, 1996; Kiseleva et al., 1998; Danker & Oberleithner, 2000; Oberleithner et al., 2001 - (Full Text)

Transloca��o de �cidos Nucl�icos

Kasianowicz et al., 1996; Szabo et al., 1997, 1998; Hanss et al., 1998; Akeson et al., 1999; Lubensky & Nelson, 1999; Meller et al., 1999

Revis�es

Antes de 2001: Bustamante, 1994b; Bustamante et al., 1994c; Matzke & Matzke, 1996; Stehno-Bittel et al., 1996; Perez-Terzic et al., 1997; Bustamante & Varanda, 1998 (HTML or PDF Reprint); Malviya & Rogue, 1998; Lee et al., 1998; Petersen et al., 1998; Verkhratsky & Petersen, 1998; Stoffler et al., 1999; Rogue & Malviya, 1999 (full text); Bezrukov, 2000; Danker & Oberleithner, 2000; Kiseleva et al., 2000;

Come�ando no 2001 Mazzanti, Bustamante & Oberleithner, 2001 (clique na capa abaixo para ver o trabalho)

Note: Somente refer�ncias com link s�o dadas, excepto em algumas exce��es.

Bibliografia geral sobre o tema

Refer�ncias de PubMed sobre NPCs nos �ltimos 30 dias.

Revis�es de PubMed Sobre NPCs nos �ltimos 5 Anos

Algumas Quest�es e Respostas: Resolvendo A Confus�o...

Nossas Publica��es Sobre Fun��o do N�cleo Celular

2001 2000a, b 1998 1996 1995a, b, c 1994a, b, c 1993a 1992a

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