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Membros do Grupo
LFN-IMN: Lab Fisiologia Nuclear do Instituto do Mil�nio de Nanoci�ncias�ITP-UNIT
Jos� Omar Bustamante
(L�der):
CV,
Credenciais,
Grupos
EMBRAPA � Tabuleiros Costeiros
Universidade de Maryland � Instituto de Virologia Humana
Robert C. Gallo
(Co-Descovridor do HIV � v�rus do AIDS)
Universidade Johns Hopkins � Instituto de Cardiobiologia Molecular
Eduardo Marb�n
Director, Institute of Molecular Cardiobiology
CV
Yahoo, Altavista, Lycos
Universidade do Estado de Nova York � Instituto de Biologia Celular
Instituto de Pesquisas da Sa�de de Fran�a
Universidade de M�nster � Instituto de Fisiologia
Hans Oberleithner
CV,
Head, Department of Physiology,
Grupos
Yahoo, Alta Vista, Lycos
Universidade de Basel � Instituto de Biologia Estrutural
Ueli Aebi
Director, Institute of Structural Biology
CV,
Grupos
Yahoo,
Alta Vista,
Lycos
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Modelo de Bustamante para a an�lise do transporte nucleocitoplasm�tico (p.ex., Bustamante et al., 1995a-d, 2000a,b; Mazzanti, Bustamante & Oberleithner, 2001). |
Descrever sucinta- e objetivamente, com o apoio da literatura:
(1) Problema(s) abordado(s),
(2) Potenciais contribui��es sociais e econ�micas dos projetos,
(3) Prioridade do(s) problema(s) e abrang�ncia geopol�tica,
(4) Segmentos da sociedade interessados na solu��o do(s) problema(s),
(5) Perdas e preju�zos s�cioecon�micos e/ou ambientais causados pelo(s) problema(s).
1. Problema(s) e Justificativa(s)
O Laborat�rio de Fisiologia Nuclear (LFN) do Instituto do Mil�nio de Nanoci�ncias (IMN), ITP-UNIT, est� envolvido com v�rios projetos.
Os projetos relacionados com a nano-biotecnologia abrangem dois setores que tem grande impacto social e econ�mico:
sa�de, biotecnologia e nanotecnologia
.
Sa�de.
Esse tema � tratado na nossa homepage
Terapia Celular.
Doen�as cancerosas, cardiovasculares e imunol�gicas dependem dos sinais que controlam a atividade e express�o dos genes em todas as fases do ciclo celular.
Os sinais entram no n�cleo celular, ou saem dele, atrav�s do complexo do poro nuclear (NPC -
nuclear pore complex:
uma estrutura biol�gica supramolecular com 100-200 nm de di�metro externo, com um canal de 9-20 nm de di�metro e de aproximadamente 126 MegaDaltons).
Conseq�entemente, o poro nuclear desempenha um papel importante na atividade e express�o dos genes nucleares (revisado em
Mazzanti, Bustamante & Oberleithner, 2001).
Nano-Biotecnologia=
Nanotecnologia + Biotecnologia.
A inser��o de genes no n�cleo celular (transfec��o) � uma das biotecnologias mais importantes do momento.
Com ela � poss�vel melhorar o estoque agropecu�rio, fazer terapia de genes e fazer clonagem de seres vivos (sim, adivinhou, aquele processo da novela O Clone).
Entretanto, a transfec��o segue sendo emp�rica e ineficiente.
Nosso recente descobrimento dos n�cleos sincitiais oferece uma nova alternativa para a gera��o de animais e plantas transg�nicas
(Bustamante, 2002).
A observa��o emp�rica de que a eletricidade ajuda � transfec��o (p.ex.,
Wilmut et al., 1997) e transloca��o de DNA (p.ex.,
Szab� et al., 1997;
Meller et al., 2001;
Salman et al., 2001;
Vercoutere et al., 2001), apoia nosso esfor�o proposto aqui.
[ Por favor, clique
aqui para visitar o Nanopore Project da Universidade da California ou aqui para ver slides do Nanopore Project].
O fato de que o poro nuclear � um nanocanal natural facilita o conhecimento de caracter�sticas n�o oferecidas por produtos artificiais j� que a natureza tem desenvolvido essa estrutura supramolecular para os fins espec�ficos da atividade e express�o dos genes.
1.2. Potenciais contribui��es sociais e econ�micas
Sa�de.
As doen�as contempladas em nossos projetos atingem seriamente a sociedade e a economia j� que elas, al�m de prejudicar a sa�de, reduzem a produtividade.
Como corol�rio, qualquer produto cient�fico que leve a reduzir a incid�ncia dessas doen�as, � uma contribui��o importante nesses aspectos.
Biotecnologia/Nanotecnologia.
O aumento da efici�ncia da transfec��o representa uma grande contribui��o � sociedade e economia. Por um lado, fornecer� novas t�cnicas de melhoras do estoque e sa�de. Por outra, proporcionar� um significativo benef�cio econ�mico dada a import�ncia comercial de novas biotecnologias.
Os resultados obtidos em nossos projetos ser�o importantes na compreens�o de alguns dos mecanismos envolvidos nas doen�as supracitadas e na biotecnologia da transfec��o.
(1) Muitos tipos de c�ncer est�o relacionados com o fator supressor de tumor p53.
(2) Muitas doen�as cardiovasculares dependem da atividade dos genes (p.ex., hipertrofia), est�o relacionadas com esses fatores e com CREB (cAMP-responsive element binding protein), PKA (cAMP-dependent protein kinase), PKC, etc.
(3) Doen�as do sistema imune est�o relacionadas ao fator nuclear kappa B: NF
1.3. Prioridade do(s) problema(s) e abrang�ncia geopol�tica
Os dois setores alvos dos nossos projetos, sa�de e biotecnologia, s�o priorit�rios e de total abrang�ncia geopol�tica no pa�s.
Al�m disso, nosso Grupo conta com redes nacionais e internacionais.
Participam em nosso Grupo, cientistas de prestigio.
Robert C. Gallo
:
Diretor do Instituto de Virologia Humana da famosa Universidade de Maryland em Baltimore (EUA),
Eduardo Marb�n
:
Diretor do Instituto de Cardiobiologia Molecular da famosa Universidade Johns Hopkins em Baltimore (EUA),
Vitaly Citovsky:
Especialista em Transporte Nuclear-Instituto de Biologia Celular e Molecular da Universidade do Estado de Nova York, Stony Brook (EUA),
Rodolphe Fischmeister:
Diretor de Pesquisas do famoso INSERM (Fran�a),
Hans Oberleithner:
Chefe do Departamento de Fisiologia, Universidade de M�nster (Alemanha),
U Aebi:
Diretor do famoso Instituto de Biologia Estrutural da Universidade de Basel (Su��a).
Colaboram com nosso LFN-IMN, v�rios grupos brasileiros
(ver, p.ex.,
The GPI
).
1.4. Segmentos da sociedade interessados na solu��o do(s) problema(s)
Por um lado, todos os cidad�os est�o preocupados com a resolu��o dos problemas de sa�de contemplados em nossos projetos.
Por outro, o setor agropecu�rio, farmac�utico e cl�nico, tamb�m est� interessado em encontrar novas biotecnologias que melhorem o estoque gen�tico agropecu�rio e a sa�de, atrav�s de incorpora��o ou terapia dos genes.
1.5. Perdas e preju�zos s�cioecon�micos e/ou ambientais causados pelo(s) problema(s)
Um ex�rcito de pesquisadores est� atualmente envolvido com o descobrimento de formas de melhoramento da sa�de e do estoque agropecu�rio.
As perdas e preju�zos causados pelo problema est�o ligados ao ponto (2) supracitado.
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Apresentar o contexto de desenvolvimento dos projetos quanto aos aspectos t�cnico-cient�ficos, ressaltando:
(1) Trabalhos sobre o mesmo tema realizado pelos membros do Grupo,
(2) Trabalhos relevantes sobre o tema realizados no Brasil e/ou Exterior.
2.1. Trabalhos sobre o tema realizado pelos membros do Grupo nos projetos
Os genes atividade � regulada por sinais que se deslocam desde o citoplasma ao n�cleo.
A maioria desses sinais usam os complexos de poros nucleares (NPCs) (localizados no envolt�rio nuclear, NE, veja Laskey, 1998). Os NPCs regulam a carga transportada atrav�s do NE (fatores de transcri��o, mRNA, etc.).
Desde 1990, patch-clamp (p.ex.,
Matzke et al., 1990;
Mazzanti et al., 1990) confirmou os experimentos cl�ssicos com microelectrodos (ver refer�ncias abaixo).
Essas observa��es apoiam a id�ia de que os NPCs tamb�m regulam o fluxo de ions (revisado em
Loewenstein et al., 1966).
O comportamento do NPC como canal i�nico pode ser visto com o paradigma do canal i�nico condutor de macromol�culas (
Bustamante et al., 1995a, ver abaixo).
Esses experimentos validam patch-clamp como um m�todo apropriado para a avalia��o da sinaliza��o nuclear e, por tanto, para a compreens�o dos mecanismos de controle da atividade e express�o dos genes.
Assim, eles s�o de relev�ncia � clonagem e terapia g�nica.
Acima mostramos o modelo do NPC de
Rout & Achison, 2001.
Para obter o v�deo de Real Player dessa figura (810 KB), por favor, clique
aqui.
O transportador (freq�entemente chamado transportador central � apesar de que n�o tem outro), � observado com AFM e EM.
Entretanto, ele n�o � observado quando o material � preparado com substratos de transporte macromolecular.
Isso sugere que o tamp�o � material fixado durante seu transporte atrav�s do NPC.
Com algumas exce��es, o entupimento do NPC e o transporte macromolecular dependem de
Ca2+
(ver abaixo) e de RanGTP (veja ilustra��es da Max Planck Society e The Scientist).
Entre 1992 e 2001, publicamos v�rios trabalhos em revistas estrangeiras nos quais demonstramos (em n�cleos celulares funcionais com poros nucleares de capacidade intacta de transporte celular) que o transporte de DNAs, RNAs, fatores de transcri��o, e outras macromol�culas, deslocam o electr�lito de dentro do poro nuclear e isso traz como conseq��ncia que a corrente el�trica gerada pelos �ons seja eliminada: esse � o princ�pio do contador Coulter (Bustamante, 1992, 1993, 1994a,b; Bustamante et al., 1994, 1995a-d, 2000a,b - veja Credenciais ). Tamb�m durante esse per�odo de tempo, ministramos palestras convidadas em v�rias reuni�es internacionais de grande import�ncia, incluindo o XXX Congresso Internacional da Uni�o de Fisiologia (St. Petersburgo, R�ssia - veja Credenciais ). No ano 1995, n�s introduzimos um modelo que explica as diversas caracter�sticas funcionais relacionadas com o poro nuclear (Bustamante et al., 1995a-d � veja Credenciais ). Manuscritos e verbas revisadas por esse proponente confirmam esse pronunciamento. Nossa teoria � agora aceita internacionalmente por biof�sicos para explicar o movimento de macromol�culas atrav�s de nanocanais biol�gicos.
Abaixo ilustramos o paradigma de nosso LFN-IMN para o comportamento de canal i�nico do NPC, o que chamamos canal i�nico condutor de macromol�culas (macromolecule-conducting ion channel - p.ex., Bustamante et al., 1995a, 2000a).
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Atualmente nosso LFN-IMN investiga a estrutura e fun��o do NPC com
patch-clamp,
microscopia confocal,"
microscopia de for�a at�mica (AFM � colabora��o com Prof. Dr. Hans Oberleithner e Prof. Dr. Ueli Aebi) e,
microscopia eletr�nica de transmiss�o (TEM) e de emiss�o de campo (FESEM � colabora��o com Hitachi Am�rica).
Nossos resultados demonstram que, devido a sua incapacidade (ou capacidade reduzida) de ser portadores de carga el�trica, as macromol�culas (fatores de transcri��o, DNAs e RNAs, etc.) e outras part�culas (naturais ou n�o) reduzem a condut�ncia i�nica do canal do NPC (p.ex.,
Bustamante et al., 1995a).
Esse paradigma (veja anima��o abaixo) foi aplicado recentemente � medi��o de �cidos nucl�icos (p.ex.,
Kasianowicz et al., 1996;
Hanss et al., 1998;
Akeson et al., 1999;
Lubensky & Nelson, 1999;
Meller et al., 1999). A medida que o
tamanho macromolecular aumenta, o NPC fica entupido e isso faz com que o fluxo dos ions pare.
Esse efeito � similar ao usado no contador Coulter (p.ex.,
Bezrukov et al., 1994 ;
Bezrukov & Kasianowicz, 1997;
Merzlyak et al., 1999).
Para uma revis�o sobre o contador molecular Coulter, veja Bezrukov (2000).
A Fig 2 de Daneholt (1997) ilustra uma part�cula de RNP (RNA de alto peso molecular associada com prote�nas) sendo exportada (com permiss�o).
O estudo por Kiseleva et al. (1998) com FESEM demonstra as intera��es entre mRNA e NPCs.
Nosso paradigma � mostrado abaixo (ver Bustamante et al., 1995a).
Note que entupimento do canal central do NPC foi proposto na base de microscopia de fluoresc�ncia (ver p�gina 350 da revis�o de Reiner Peters
Peters, 1986; ver tamb�m
Keminer & Peters, 1999).
Canais i�nicos mitocondriais tamb�m mostram entupimento.
Clique
aqui com o bot�o da direita para ver algumas referencias sobre esses outros canais.
Canais ionicos condutores de prote�nas foram observados no ret�culo endoplasm�tico (ER) (veja
Simon et al., 1989;
Simon & Blobel, 1991,
1992).
Finalmente, canais ionicos da membrana tilakoide das plantas tamb�m mostram entupimento quando est�o conduzindo prote�nas (p.ex.
Teter & Theg, 1998).
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Nosso trabalho no campo do poro nuclear come�ou no Instituto de Cardiologia da Universidade de Ottawa, no mesmo ano em que apareceram as duas pioneiras publica��es de patch-clamp nuclear (Matzke et al., 1990; Mazzanti et al., 1990). Publicamos os primeiros registros da atividade i�nica do poro nuclear em 1992 (Bustamante, 1992). Esse trabalho foi seguido por outros nos que identificamos as qualidades dessa atividade (Bustamante, 1993, 1994a,b). A necessidade de incorporar conceitos de biologia celular e molecular fez necess�ria nossa mudan�a para University of Maryland School of Medicine-Baltimore. Essa mudan�a tamb�m permitiu a aplica��o de tecnologias de visualiza��o ou imaging n�o dispon�veis nesse momento em Canad�. Especificamente: microscopia confocal (com hardware de laser e com software de deconvolu��o), microscopia de alta sensibilidade (incluindo photon-counting), microscopia eletr�nica de varredura de ponta (FESEM). Essas tecnologias tem muito peso na escolha da c�mera de CCD intensificada que � solicitada nessa proposta. Para completar nosso treinamento nas t�cnicas necess�rias para nosso trabalho sobre o NPC, mudamos para Yale University School of Medicine onde trabalhamos com nosso colega atual, John P. Geibel. A experi�ncia foi importante j� que somente a 2 metros de dist�ncia de nosso equipamento de patch-clamp, estavam os microsc�pios confocal e de for�a at�mica (AFM) de John. Nossa demonstra��o pioneira da origem da atividade de canal i�nico de alta condut�ncia com o poro nuclear (Bustamante et al., 1995a-d) e nossa observa��o tamb�m pioneira da diminui��o at� zero de tal condut�ncia durante TMM atrav�s do poro (Bustamante et al., 1995a-d) j� foram citadas nas seguintes publica��es referenciadas. Na tabela mostrada abaixo, sintetizamos os est�gios de nosso desenvolvimento no campo. [ Por raz�es obvias, nossas publica��es s�o citadas em nossas publica��es. Por isso, somente inclu�mos nossas tr�s refer�ncias de revis�o bibliogr�fica. ]
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Est�gios de Desenvolvimento:
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Refer�ncias:
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2.2. Trabalhos sobre o tema, realizados no Brasil e/ou Exterior
At� o momento, somente nosso LFN-IMN tem publicado nessa �rea. A raz�o parece bastante simples: � altamente dif�cil obter uma prepara��o de n�cleo isolado que mantenha suas propriedades estruturais e funcionais. Nosso sucesso n�o � um resultado aleat�rio. O leitor pode apreciar do Curr�culo do L�der do Grupo que o mesmo foi o primeiro em isolar mi�citos card�acos adultos (humanos e n�o humanos) com boas propriedades estruturais e funcionais (Bustamante et al., 1981, 1982a,b).
O campo de estudo quantitativo da din�mica da transloca��o de DNA atrav�s do NPC (i.e., a transfec��o) � relativamente novo e virgem. O conhecimento dos mecanismos de transporte macromolecular (TMM), segue aumentando. Por exemplo, recentemente foram reconhecidos sinais diferentes aos de importa��o e exporta��o (p.ex., Michael, 2000). A transloca��o de DNA atrav�s da membrana nuclear (p.ex., Whittaker & Helenius, 1998) � mat�ria de pesquisa intensiva para patentes de biotecnologia. No caso do plasm�deo pEGFP-C1 que usaremos (com ou sem pin�a de rodamina, e com ou sem os c�dons para as prote�nas de fus�o), � suficiente para o DNA possuir uma seq��ncia � qual se liguem fatores de transcri��o (transcription factors, TFs) os quais tem NLSs (ver Bustamante et al., 2000b; Dean, 1997; Dean et al., 1999; Wilson et al., 1999; Zanta et al., 1999). Assim, os TFs combinados com o pEGFP-C1 s�o reconhecidos pelos receptores de importa��o e, esses receptores v�o ao sitio de reconhecimento no NPC. As primeiras observa��es dos efeitos do transporte de DNA sobre a atividade de um canal i�nico foram publicadas por Kasianowicz et al. (1996) e Szab� et al. (1997). Essa observa��o foi usada recentemente para deslocar o DNA atrav�s de um nanoporo (Meller et al., 2001). Os dois trabalhos citam nossa observa��o e paradigma do comportamento do NPC como canal i�nico condutor de macromol�culas (Bustamante et al., 1995a). Seguindo o principio do molecular Coulter counter, MCC, cada vez que uma macromol�cula como pDNA esta passando pelo canal i�nico, a macromol�cula entope o canal e impede o fluxo dos carregadores de carga el�trica (�ons) atrav�s do NPC, o que por sua vez, � traduzido em aus�ncia de corrente i�nica no registro de patch-clamp (Bustamante et al., 2000c). Mas, no momento em que a macromol�cula entra na boca do poro, � poss�vel observar uma diminui��o exponencial (com dura��o de v�rios segundos) da condut�ncia do NPC (Bustamante et al., 1995a). O mesmo fen�meno � observado no momento em que a macromol�cula come�a a sair do poro nuclear (s� que no sentido oposto). Deste modo, � poss�vel quantificar a cin�tica de entupimento e desentupimento com equa��es diferenciais de primeira ordem. O tempo de sil�ncio corresponde ao tempo que a macromol�cula est� dentro do poro, sofrendo as for�as de transloca��o exercidas pelos mecanismos dependentes dos componentes do NPC.
O uso de nanoporos para a detec��o de part�culas (p.ex., Bezrukov et al., 1994; Parsegian et al., 1995; Rostovtseva & Bezrukov, 1998; veja tamb�m Vodyanoy & Bezrukov, 1992; Bezrukov & Vodyanoy, 1993), tem sido bem revisado por Bezrukov (2000) - National Institutes of Health. Por raz�o de espa�o limitado, referimos ao leitor essa revis�o. No Brasil, o grupo de Krasilnikov-UFPE tem produzido importantes trabalhos nesse campo (p.ex., Krasilnikov et al., 1992, 1996, 1998a,b, 1999) e o mesmo est� colaborando com Bezrukov (ver Merzlyak et al., 1999). V�rios trabalhos tratam de c�lculos da geometria de nanoporos ou nanocanais com a manipula��o de solu��es eletrol�ticas ou de c�lculos da geometria dos solutos a partir da resposta dos poros ou canais. Para esses fins, usam-se metodologias de abertura de canal ou de an�lise de ru�do dos registros de corrente el�trica atrav�s dos canais estudados (tanto artificiais como naturais: VDAC,
a-hemolisina, alameticina, etc.). [Nota: Estudos por outros laborat�rios � p.ex., Colombini - n�o s�o citados por raz�es de espa�o e da relev�ncia do tema nos projetos de pesquisa]. Achamos muito importante para nossos projetos a compatibilidade de nossas observa��es experimentais com esses estudos. Brevemente, ao contr�rio do que usualmente � observado com experimentos cl�ssicos de canais i�nicos, observamos que a condut�ncia i�nica do canal e os coeficientes de difus�o s�o menores do esperado com a aproxima��o ideal de solu��o dilu�da (p.ex., Rostovtseva & Bezrukov, 1998). Obviamente, dentro do poro nuclear (e, em sua vizinhan�a), n�o temos tais condi��es ideais. Ao contr�rio, a grande quantidade de part�culas que n�o servem como transportadores de cargas el�tricas faz com que a condut�ncia fique reduzida. E, ainda mais interessante, parece que esses poros (de dimens�es maiores aos dos poros cl�ssicos de Na+ e K+), t�m fen�menos diferentes aos cl�ssicos. Por exemplo, Rostovtseva & Bezrukov (1998) encontraram que o poro do VDAC (voltage-dependent anion channel da mitoc�ndria) parece concentrar part�culas. A seguir, reproduzimos para o beneficio do leitor, a explica��o simples que damos em nosso trabalho recente (Bustamante et al., 2000b). O leitor tamb�m pode encontrar �til visitar o site de internet de nosso laborat�rio: The NPL.Como nosso trabalho usa as transi��es de estado: aberto-fechado, usamos a condut�ncia de canal,
g, com g=Di/V (onde Di � a altera��o do valor de corrente de um estado a outro e V � a voltagem atrav�s das faces intra- e extranuclear � e assumimos como � costume, que V � independente). Como Di � o fluxo das cargas el�tricas, q, temos que Di=dq/dt (onde t � tempo - vari�vel independente). Ignorando os efeitos de hidrata��o, em considera��o ao grande di�metro do poro nuclear, temos que g =(dq/dt)/V. A rela��o entre condut�ncia m�xima (gm�x) e reduzida (greduz) pelas part�culas n�o transportadoras de cargas � (gm�x/greduz)=(dq m�x/dqreduz). A quantidade m�xima de cargas el�tricas, dqm�x, no volume m�ximo dispon�vel, vm�x, � igual � concentra��o de cargas ([K+] en nosso caso, ver Bustamante, 1992, 1993) vezes vm�x: dqm�x=[K+]vm�x. Da mesma forma, a quantidade de cargas, dqreduz, no volume reduzido, vreduz, � dqreduz=[K+]vreduz. O volume reduzido � igual ao volume m�ximo dispon�vel reduzido pelo volume ocupado pelas part�culas que n�o carregam carga: vreduz=vm�x�x (h vm�x)=vm�x (1-x h). Onde h � a concentra��o dessas part�culas e x � o volume das part�culas individuais (p.ex., se o di�metro delas � d, ent�o, a concentra��o � (4/3)p (d/2)3, ou p d3 /6. Da� temos que a rela��o (gm�x/g reduz)=([K+]vm�x)/([K +]v reduz)=(1-x h)-1, ou seja,g reduz =(1-x h)gm�x.
Esta rela��o quantitativa � uma forma simplificada de representar os efeitos de mol�culas n�o carregadoras de cargas na condut�ncia do poro (p.ex., Gu et al., 1999). Nosso trabalho, por�m, ser� analisar a rela��o entre a transloca��o de DNA (i.e., transfec��o), as for�as do transporte macromolecular, TMM, e for�a el�trica. Como durante a transloca��o do DNA, as part�culas carregadoras de cargas el�tricas s�o exclu�das, a corrente el�trica � zero (p.ex., Bustamante et al., 2000c). Por isso, nossa an�lise ser� baseada na aus�ncia de sinal (i.e., corrente zero). Esse efeito j� foi reportado por v�rios laborat�rios. Assim, a equipe do Dr. Mario Zoratti reportou redu��o de corrente durante a transloca��o de DNA atrav�s de poros mitocondriais (p.ex., Szab� et al., 1997, 1998). O fen�meno � tamb�m observado com poli-anions (p.ex., B�thori et al., 1998). Nesse �ltimo caso, uma reduzida condut�ncia pode ser observada o qual pode ser confundida com um sub-estado do canal (ver Bustamante, 1994a). O NPC � um nanoporo que pode ajudar o desenho de futuras terapias. O uso de nanoporos e nanocanais para a terapia � um campo muito ativo (p.ex., Bayley, 1997). A evid�ncia experimental obtidas por nosso laborat�rio e por outros, indica que � poss�vel fazer o estudo proposto e, que o trabalho pode ser de consider�vel import�ncia socio-econ�mica.
O uso de nanoporos para injetar drogas e outras subst�ncias nas c�lulas e n�cleos celulares e, mais recentemente, para seq��nciamento de macromol�culas - (veja, p.ex., Nature Biotechnology, julho 2001) � um campo importante para a biotecnologia e nanotecnologia (p.ex., Bayley, 1997; Deamer & Akeson, 2000; Howorka et al., 2001; Wang & Branton, 2001- por favor, visite as homepages de seus laborat�rios: Texas A&M U; Harvard U- Homepage No. 1; Harvard U-Homepage No. 2). Sem aparente conhecimento do poro nuclear, pesquisadores em F�sica e Qu�mica (o leitor deve lembrar que o L�der deste Grupo � graduado em F�sica) come�aram a desenhar e construir canais eletrol�ticos para estudar o DNA. Assim, o grupo do Prof. Dr. Harold G. Craighead (Cornell Univ Escola de F�sica Aplicada e Eng. F�sica) tem publicado v�rios trabalhos importantes (p.ex., Han & Craighead, 1999; Han et al., 1999 � o leitor interessado, poder� encontrar valiosa informa��o na homepage do grupo de Cornell). De interesse � a observa��o deles que, ao contr�rio do pensamento tradicional de canais i�nicos, as mol�culas de DNA que s�o mais longas propagam-se a maior velocidade.
Eles atribu�ram esse fen�meno ao fato da maior �rea de contato com as paredes do canal para as maiores mol�culas (Han & Craighead, 1999; Han et al., 1999). Que a transloca��o macromolecular n�o pode ser analisada com o modelo simples de difus�o de Fick tamb�m foi discutido por Wei et al. (2000). � por isso que a descri��o quantitativa da cin�tica de transfec��o atrav�s do NPC n�o poder ser analisada simplesmente com as equa��es de difus�o. Essas equa��es s�o fundamentalmente as equa��es de Fick aplicadas ao poro (p.ex., Keminer & Peters, 1999; Keminer et al., 1999). Infelizmente, elas tamb�m s�o usadas para estimar o di�metro do canal eletrol�tico do poro; o que, como explicamos acima inevitavelmente leva a erros na estimativa desse valor e da condut�ncia (ver Bustamante & Varanda, 1998). Um trabalho recente (Meller et al., 2000 - Dept. Mol. Cell. Biol. & Div. Engin. Appl. Sci, Harvard Univ.) demonstra o potencial de aplica��o desta proposta em biotecnologia e nanotecnologia. Meller et al. (2000) injetaram, eletrofor�ticamente, diferentes pol�meros de DNA atrav�s de nanoporos de
a-hemolisina. Os registros de patch-clamp da atividade de canal individual (ou falta dela) mostraram a dura��o da transloca��o desses pol�meros. Al�m disso, � interessante notar que eles observaram padr�es de eventos �nicos para cada um dos pol�meros testados. Os dados estat�sticos derivados desses padr�es demonstraram em v�rios casos, que o nanoporo pode distinguir entre polinucleot�dios de comprimento similar e composi��o que difere somente em seq��ncia (isso � muito importante). Meller et al. (2000) conclu�ram que: os nanoporos testados podem discriminar e caracterizar rapidamente as mol�culas de DNA que n�o est�o marcadas com sondas de algum tipo. E, por isso, refinamentos do m�todo experimental deles podem fornecer um m�todo de baixo custo (mas alta efici�ncia) para a an�lise de polinucleot�dios de DNA. Em resumo, os dados obtidos com a pesquisa da presente proposta tamb�m ser�o �teis na implementa��o de um sistema quantitativo para a an�lise do DNA e da sua din�mica atrav�s dos poros nucleares e outros nanocanais. O trabalho realizado durante os 3 anos iniciais do estudo proposto possibilitar� a elabora��o de s�ries e protocolos de experimenta��o para testar a hip�tese que os padr�es dos registros de patch-clamp podem servir para caracterizar mol�culas de DNA de diversas propriedades.
Mecanismos estabelecidos de transloca��o nuclear
(veja
Mazzanti, Bustamante & Oberleithner, 2001).
Clique na figura de acima com o bot�o da direita do mouse para figura de dimens�o maior.
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Princ�pio de
Patch-Clamp
para o registro de sinais do poro nuclear.
Confira a teoria e pr�tica de patch-clamp de
Axon Instruments
ou do
Curso de Nanobiotecnologia de Cornell University
(1) Explicitar os objetivos da proposta de ci�ncia, tecnologia e/ou desenvolvimento tecnol�gico, suas metas e justificativas,
(2) Descrever os resultados e/ou produtos esperados,
(3) Estimar a repercuss�o e/ou impactos s�cio-econ�micos, t�cnico-cient�ficos e ambientais.
3.1. Objetivos, metas e justificativas
Esperamos que as atividades de nosso Grupo contribuam da seguinte forma:
(1) Terapias para o controle de alguns tipos de c�ncer e algumas doen�as dos sistemas cardiovascular e imune.
Para isso, desenvolveremos m�todos farmacol�gicos e de terapia dos genes que usar�o as observa��es feitas durante nossos experimentos sobre a sinaliza��o celular.
Todos os modelos experimentais utilizados s�o aceitos pela comunidade cient�fica.
C�ncer e doen�as dos sistemas cardiovascular e imune apresentam um problema muito s�rio para a sa�de.
As vias de sinaliza��o que ser�o estudadas s�o importantes nas etiologias dessas doen�as.
(2) T�cnica de transfec��o de efici�ncia superior �s das t�cnicas atuais.
Para isso, desenvolveremos m�todos biof�sicos e bioqu�micos envolvendo: campos el�tricos, biologia molecular, etc. Acreditamos que um produto patente�vel seja desenvolvido dentro de 3 anos.
(3) Programa de treinamento de graduandos, p�s-graduandos e PhD�s.
Para isso, aproveitaremos os programas existentes nas institui��es participantes.
Al�m disso, nosso Laborat�rio de Fisiologia Nuclear conta com 120 m
Esperamos chegar a contribuir dessa forma seguindo os seguintes passos:
(1) Identifica��o e quantifica��o das vias de sinaliza��o celular que regulam o ciclo celular em condi��es que levam ao c�ncer e hipertrofia card�aca e defici�ncia imune.
Para isso, aplicaremos as t�cnicas dispon�veis em nosso laborat�rio e nos laborat�rios participantes.
(1)
Estudaremos os mecanismos de desenvolvimento de hipertrofia card�aca pois j� trabalhamos anteriormente com essa doen�a no Inst de Cardiologia da Univ Ottawa (p.ex., Bustamante et al., 1991) e na Escola de Medicina de Yale.
O est�mulo usado ser� aquele de sobrecarga mec�nica que � bem aceito pela comunidade cient�fica.
(2)
Estudaremos os mecanismos de desenvolvimento de doen�as imunes em camundongos tratados com supressores do sistema imune (ver Liepins & Bustamante, 1994).
(3)
Os mecanismos de desenvolvimento de c�ncer s�o muito variados.
Usaremos nossa experi�ncia com c�ncer de pr�stata (p.ex., Bustamante et al., 2000a) para estudar a sinaliza��o das c�lulas cancerosas.
Para esses estudos aproveitaremos nossa experi�ncia (p.ex., Bustamante et al., 2000a,b) na incorpora��o de DNA no n�cleo celular para a produ��o intr�nseca de prote�nas de fus�o de v�rios sinais celulares com membros da fam�lia da prote�na de fluoresc�ncia verde, EGFP.
Por exemplo, para observar o papel do cAMP, atrav�s da sua quinasse PKA, injetaremos o plasm�dio pPKA-pEGFP, o qual codifica para PKA fusionada com EGFP (PKA-EGFP).
Tamb�m testaremos o papel de
Ca
(2) Identifica��o e quantifica��o dos par�metros que otimizam a transfec��o.
Para isso, quantificaremos os valores de campo el�trico e estabeleceremos a rela��o geral mecan�stica, causa-efeito (i.e., Segunda Lei de Newton generalizada), que regula o movimento das macromol�culas atrav�s do poro nuclear. Nosso desenvolvimento de meios que permitem a transfec��o e express�o de prote�nas � muito importante comercialmente.
Como j� existem patentes sobre esse tipo de material (p.ex., de Promega, Ambion), antecipamos que nossos projetos possam levar ao desenvolvimento de subst�ncias que possam ser comercializadas e, por isso, patenteadas.
(3) Implanta��o de um programa educacional que forne�a a base de treinamento e capacita��o a todos os n�veis.
Todas as institui��es estrangeiras que participam nessa proposta atrav�s do LFN-IMN tem implantados programas de capacita��o acad�mica.
Esses programas tem grande prestigio internacional.
Todas as institui��es tem vagas, espa�o e materiais para treinamento a todos os n�veis.
3.2. Resultados e/ou produtos esperados
Nossos projetos contribuir�o ao conhecimento da fun��o do poro nuclear e seu envolvimento na fun��o e modula��o da atividade g�nica.
Tamb�m contribuiremos no conhecimento dos princ�pios da transfec��o.
3.3. Repercuss�o/impactos s�cio-econ�micos, t�cnico-cient�ficos e ambientais
Nossas contribui��es ser�o importantes n�o s� no aspecto t�cnico-cient�fico, mas tamb�m ter�o impacto econ�mico e, conseq�entemente, social.
Nossos esfor�os ajudar�o a estabelecer os princ�pios de funcionamento do poro nuclear em rela��o ao movimento dos fatores que determinam a fun��o dos genes e seus produtos prot�icos - que determinam a estrutura e fun��o das c�lulas.
Com isso ser� poss�vel novas t�cnicas para o melhoramento do estoque e da sa�de.
Antecipamos que algumas dessas t�cnicas possam ser patenteadas (p.ex., transfec��o).
Como resultado, contribuiremos ao desenvolvimento econ�mico de nossa regi�o nordestina e do pa�s.
� imposs�vel n�o associar o desenvolvimento social sem apoio econ�mico.
Por isso, acreditamos que as contribui��es econ�micas possam ser traduzidas em beneficio social.
Apesar de n�o beneficiar imediatamente ao ambiente, nossa pesquisa nos mecanismos do poro nuclear produzir� conceitos que podem ser aplicados ao desenvolvimento de t�cnicas que beneficiem ao ambiente (veja, por exemplo, a atividade de nosso LFN-IMN na �rea da mar� vermelha/algas nocivas:
Rede Mangue).
O esfor�o na �rea da biotecnologia e nanotecnologia da transfec��o de DNA e do poro nuclear merece tamb�m ser ressaltado. A import�ncia desse campo � apoiada pelo reconhecimento de revistas de grande prestigio sobre o assunto.
Descrever, em termos qualitativos e quantitativos, a infra-estrutura existente.
(1) Material permanente,
(2) Equipamentos,
(3) Material dispon�vel.
Para ver uma lista que descreve esses itens clique
aqui
.
3. Objetivos, metas e justificativas
4. Infra-estrutura dispon�vel
(1) Nome e descreva todos os pesquisadores envolvidos no grupo e sua linha principal de pesquisa, (2) Descreva como o grupo formar� novos pesquisadores, (3) Para pesquisadores estrangeiros, apresente um resumo breve no excedendo 2 p�ginas.
5.1 Atividades cient�ficas de cada participante brasileiro
Atualmente, nosso LFN-IMN encontra-se colaborando com v�rias institui��es do pa�s atrav�s de v�rios projetos (ver, p.ex., Nano Canais do Instituto do Mil�nio de Nanoci�ncias (MCT-CNPq), Nano Canais da Rede Nacional de Materiais Nanoestruturados (MCT-CNPq), Dinoflagelados da Rede PROAMB (MCT-FINEP), Terapia Celular (n�o oficial), Em particular, temos grande interesse em dar seguimento ao esfor�o que realizamos para a organiza��o (n�o aprovada) da pr�-proposta do Instituto do Mil�nio do Patrim�nio gen�tico
5.2 Curr�culos de cada participante estrangeiro
Robert C. Gallo
nasceu em Waterbury, Connecticut, EUA, em 23 de mar�o de 1937. A caracter�stica mais destacada do Dr. Gallo � o fato de ser co-descobridor do HIV, o v�rus do AIDS. Atualmente, o Dr. Gallo � o Diretor do Instituto de Virologia Humana da Universidade de Maryland em Baltimore. Como o leitor deve apreciar, � imposs�vel, dentro do espa�o dispon�vel fazer justi�a relatando os logros cient�ficos do Dr. Gallo. Por isso, pedimos ao leitor, consultar os links de internet dados ao come�o desta homepage para o Grupo de Nano-Biotecnologia ITP-UNIT.Eduardo Marb�n
nasceu em Cuba, 8 de janeiro de 1954. Ele foi recentemente nomeado Diretor do Instituto de Cardiobiologia Molecular do The Johns Hopkins University. Em 1974 recebeu seu B.Sc. em Matem�tica, em 1980 graduou-se em Medicina na Yale University, e em 1981 Ph.D. em Fisiologia na Universidade de Yale. Ele t�m recebido muitos pr�mios. � membro de muitos comit�s dos Estados Unidos e internacionais. Ele � editor associado/consultor em muitas revistas cient�ficas de prest�gio. Como inventor, possui v�rias patentes, incluindo aquelas relevantes aos objetivos de nosso Grupo. Por exemplo, ele inventou Methods for Somatic Transfer of Modified Genes to Predict Drug Effects. Ele j� publicou 159 trabalhos em revistas de prest�gio internacional. Publicou tamb�m revis�es em publica��es igualmente prestigiosas, somando 216 publica��es no total. O n�mero de resumos publicados � igualmente significativo. Ele editou o livro: Molecular Approaches to Heart Failure Therapy.Vitaly H. Citovsky
nasceu em 11 de julho de 1958, Moscou. O homem que descobriu que o Agrobacterium tumefaciens pode existir bem e infetar seres humanos (veja nossa homepage), cruzando assim reinos. Ele � um importante cientista que trabalha nas intera��es v�rus-plantas. Ele recebeu seu Ph.D. na University of California-Berkeley, e depois treinou com a especialista em plantas, Dr. P. Zambryski na mesma institui��o. O Dr. Citovsky trabalha na State University of New York � Stony Brook, Institute for Cell and Developmental Biology, onde ele comanda mais de US$1.000.000,00 em verbas de varias ag�ncias. Ele � membro de bancas editoriais de Plant Physiology e Molecular Plant Pathology. � membro da American Phytopathological Society, da American Society for Plant Physiology, e da British Society for Plant Pathology. Dr. Citovsky recebeu at� hoje v�rios pr�mios importantes, e ele foi palestrante convidado de muitas reuni�es cient�ficas. Ele tem um total de 80 publica��es em jornais e livros importantes e � hoje o editor de um livro sobre transporte nuclear do qual o Coordenador de essa pr�-proposta � um contribuinte. Dr. Citovsky traz ao Instituto grande vis�o em fisiologia e biologia celular e molecular das plantas. Ele tem 3 patentes: (1) Protein-Mediated Nuclear Import of DNA, (2) Genetic Assay for Protein Nuclear Import, e (3) Production of Plants Resistant and Super-Susceptible to Genetic Transformation by Agrobacterium. Dr. Citovsky tem muito espa�o laboratorial, equipamentos, materiais e grande disposi��o para treinar nosso pessoalRodolphe P. Fischmeister
nasceu em 2 de junho de 1955, Fran�a. Desde 1996, ele � o Diretor de Investiga��es da mais prestigiosa institui��o cient�fica da Fran�a: INSERM. Ele � Diretor de Laborat�rio e Chefe do Instituto de Cardiologia Celular e Molecular. O Dr. Fischmeister recebeu seu B.Sc.-Matem�tica & F�sica em 1975 da Universidade de Orsay. Em 1978, ele recebeu seu Diploma em Engenheira da Escola Superior de Eletricidade. Em 1980, ele recebeu seu Diploma de Doutor em Engenharia (Ph.D.) em Fisiologia e Biof�sica da Universidade de Paris. Em 1987, ele recebeu seu Ph.D. em Ci�ncias Naturais da mesma institui��o. Desde 1988 ele � Chefe do Instituto de Sinaliza��o e Inova��o Terap�utica da Universidade de Paris. Desde 1989, ele ocupou cargos muitos importantes. Ele � membro de v�rias sociedades prestigiosas, relator externo para v�rios jornais e organiza��es. Ele j� foi palestrante convidado em muitos congressos internacionais e da Fran�a. Ele publicou mais de 78 trabalhos em jornais e livros e, um n�mero ainda maior de resumo.Hans Oberleithner
nasceu em 2 de mar�o de 1950, Austria. O Prof. Oberleithner recebeu seu M.D. da Universidade de Innsbr�ck em 1975. Durante 1979-82, foi Fogarty Fellow no Departmento de Fisiologia da Escola de Medicina de Yale University. Desde 1997, ele � Professor Titular e Chefe do Departmento de Fisiologia da Universidade de M�nster. Ele publicou v�rios trabalhos com nosso laborat�rio (i.e., Bustamante) e tem mais de 141 publica��es referenciadas. Ele est� na frente em produ��o cient�fica no campo da microscopia de for�a at�mica aplicada ao n�cleo celular e poros nucleares. O Prof. Dr. Oberleithner j� foi palestrante convidado em muitas confer�ncias internacionais e nacionais. Ele pertence a muitas organiza��es prestigiosas e tem supervisado grande n�mero de estudantes da gradua��o, p�s-gradua��o e de bolsistas de p�s-doutoramento.Ueli Aebi
nasceu em 31 de maio de 1946, Su��a. O Dr. Aebi recebeu seu M.Sc. em F�sica, Mat e Astronomia em 1972 (Univ Bern) e seu M.Sc. Biologia Molecular em 1974 (Univ Basel). Em 1977 recebeu seu Ph.D. em Biologia Molecular e Biof�sica. Desde 1986 � Professor e Diretor do M.E. M�ller Institute for Structural Biology no Biozentrum, University of Basel. Desde 1990 ele � o Chefe da Microscope Facility no Biozentrum. Ele comanda uma grande quantidade de equipamentos de ponta (muitos n�o encontrados em nenhum outro lugar) para estudos estruturais: desde microsc�pios de raios X a microsc�pios de varredura usando emiss�o de campo, etc. Ele tem mais de 175 publica��es referenciadas e muito mais resumos. Ele foi convidado muitas vezes (em confer�ncias e por editoras) a mostrar suas impressionantes imagens dos poros nucleares e superf�cie nuclear. Ele j� supervisou dezenas de estudantes de gradua��o, p�s-gradua��o e bolsistas de p�s-doutorado. O Dr. Aebi mant�m fortes colabora��es com industrias farmac�uticas e de instrumentos assim como com institui��es acad�micas e federais.5.3 Programa para Forma��o de Novos Pesquisadores
As institui��es estrangeiras que colaboram com o nosso LFN-IMN tem excelentes programas e capacidade para nossos futuros pesquisadores. Esses programas estar�o dispon�veis aos pesquisadores do Instituto de Nanoci�ncias.
5.4 Programa de interc�mbio cient�fico (nacional e internacional)
O nosso LFN-IMN pretende envolver-se, atrav�s da rede criada pelo Instituto de Nanoci�ncias, no interc�mbio cient�fico nacional e internacional.
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Nota:
A maioria das refer�ncias tem link com o resumos dado pela PubMed.
Algumas delas tamb�m tem link com o texto completo.
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7.1. Metodologia e estrat�gia de a��o
A Metodologia ser� aquela que desenvolvemos desde o ano 1990 (p.ex., Bustamante, 1992, 1993, 1994a,b; Bustamante et al., 1995a-d, 2000a,b - revisado em Mazzanti, Bustamante & Oberleithner, 2001). A Estrat�gia � baseada na experi�ncia anterior e posterior � chegada ao Brasil (1997) do L�der deste Grupo.
Os alvos est�o bem definidos.
Os resultados obtidos em nosso laborat�rio ser�o testados com medi��es de microscopia eletr�nica e de for�a at�mica por nossos colaboradores Ueli Aebi (Su��a) e Hans Oberleithner (Alemanha).
Eles tamb�m ser�o conferidos com t�cnicas similares por Eduardo Marb�n e Vitaly Citovsky (EUA) e Fischmeister (Fran�a).
As institui��es participantes tem programas de gradua��o, p�s-gradua��o e p�s-doutoramento. Isso garante o sucesso de nossas metas e objetivos.
Medi��es de distribui��es de sinais ser�o feitas com fluoresc�ncia.
Medi��es de permeabilidade de membrana s�o feitas com corrente el�trica. Nessas condi��es, os n�cleos fabricam DNA, RNA e mostram transporte macromolecular atrav�s dos NPCs.
A prepara��o (n�cleo+meio) produz prote�nas (Bustamante et al., 2000a,b; Bustamante et al. + Bustamante & Dean, em considera��o por editoriais).
Usaremos o pDNA que codifica para a prote�na de fluoresc�ncia verde (pEGFP-C1).
J� demonstramos que esse plasm�dio entra no n�cleo e produz mRNA que depois � usado na s�ntese de EGFP (enhanced green fluorescence protein). As vias de sinaliza��o s�o estudadas com dois grupos de sondas fluorescentes.
O primeiro grupo usa o fato que a pEGFP entra no n�cleo e funciona corretamente. Baseado nisso, utilizamos plasm�dios da familia pEGFP (p.ex., pPKA-pEGFP, pPKC-pEGFP, pp53-pEGFP, pNF
Tr�s metodologias de nosso laborat�rio facilitam a realiza��o dos esfor�os de nosso Grupo (ver equipamento dispon�vel em
Credenciais).
(1) N�cleos isolados com capacidade de transcri��o e TMM (Bustamante et al., 2000a-c).
(2) Extrato celular (TTT) que fornece suficiente substratos para transcri��o, para TMM e para tradu��o (Bustamante et al., 2000b,c).
(3) Sistema integrado de micromanipula��o e microscopia que possibilita registros de patch-clamp e fluoresc�ncia por v�rios dias (p.ex., Bustamante et al., 1995a-d; 2000a-c).
Esses logros permitem duas coisas antes imposs�veis.
(1) Patch-clamp direto do n�cleo funcional. Antes de nossa contribui��o, a prepara��o mais usada para o estudo de TMM era a c�lula permeabilizada (o qual impede a coloca��o da pipeta de patch-clamp sobre o envolt�rio nuclear).
(2) A microscopia de fluoresc�ncia simult�nea ao patch-clamp.
Em nosso laborat�rio � poss�vel estudar a atividade de canal i�nico do complexo do poro nuclear (NPC - nuclear pore complex) simultaneamente ao monitoramento de fatores/prote�nas de sinaliza��o celular j� que podemos expressar eles fusionados com membros da fam�lia da prote�na de fluoresc�ncia verde aumentada, EGFP.
Isso � realizado simplesmente adicionando ao TTT, o pDNA que codifica para EGFP (pEGFP, ver Bustamante et al., 2000a-c) sem necessidade de estar fusionada com um sinal de localiza��o nuclear (NLS - nuclear localization signal).
Como mostramos (Bustamante et al., 2000a-c), � suficiente para pEGFP possuir uma seq��ncia � que estejam ligados fatores de transcri��o. Em 1995 (Bustamante et al., 1995a-d) introduzimos o conceito que no n�cleo celular TMM pode ser detectado com patch-clamp usando o principio do molecular Coulter counter (MCC) para contar pol�meros com nanocanais (Bezrukov et al., 1994; ver revis�o de Bezrukov, 2000). Pouco depois, Kasianowicz et al. (1996) e Szab� et al. (1997, 1998) demonstraram o uso do MCC na detec��o da transloca��o de DNA atrav�s de canais da membrana mitocondrial (ver B�thori et al., 1998).
Um dos alvos espec�ficos de nossa proposta � a quantifica��o dos par�metros/fatores que determinam a transloca��o de DNA com voltagem em n�cleos funcionais.
Para isso, usaremos pEGFP-C1 (que possui a seq��ncia enhancer SV40 � que os fatores de transcri��o se unem) marcado com a sonda fluorescente vermelha rodamina (pEGFP-C1-Rod), produzida usando a metodologia chamada de pin�a pept�dio-�cido nucl�ico (peptide nucleic acid, PNA, clamp � p.ex., Branden et al., 1999; Wilson et al., 1999; Zelphati et al. 1999). A pin�a n�o modifica a conforma��o do pEGFP-C1 ou sua habilidade de ser eficientemente expressada (p.ex., Wilson et al., 1999).
Dessa forma, poderemos observar a cin�tica de transfec��o com o microsc�pio de fluoresc�ncia e associar essa observa��o com os par�metros de patch-clamp (condut�ncia, constantes de tempo de entupimento e desentupimento, tempo de entupimento/transloca��o, probabilidades de abertura e fechamento do canal, etc.).
Essa contribui��o � de grande utilidade na prepara��o de novas metodologias para terapia g�nica, para melhoramento gen�tico de estoques agropecu�rios e para outros usos que realmente ainda hoje pertencem � fic��o cient�fica.
Mais detalhes podem ser encontrados na
homepage do LFN-IMN.
Propomos realizar estudos de sinais de grande import�ncia para as doen�as supracitadas: NF
7.2. M�todos espec�ficos
7.2.1 Prepara��o de n�cleos isolados vivos
Esse aspecto da metodologia � de extrema import�ncia e trataremos de dar tanta informa��o como seja poss�vel dentro do espa�o limitado.
Os n�cleos ser�o isolados com nossas t�cnicas (p.ex., Bustamante, 1992, 1993, 1994a,b; Bustamante et al., 1995a-c, 2000a,b).
Brevemente, o camundongo (Swiss-Webster, 20-22 g, macho) � decapitado e seu cora��o (e/ou outro �rg�o a ser estudado) extra�do rapidamente e colocado por 5 min numa solu��o salina (mM:
150 NaCl,
10 Hepes,
5 KOH,
2 CaCl
7.2.2
O contador Coulter molecular aplicado � transfec��o de DNA
Para analisar a transfec��o el�trica de pEGFP, aplicaremos a t�cnica de patch-clamp com nossos procedimentos (p.ex., Bustamante, 1992, 1993, 1994a,b; Bustamante et al., 1995a-c, 2000a,b).
Brevemente, cada pipeta de patch-clamp � fabricada no momento de seu uso (i.e., nunca armazenada).
Isto minimiza a contamina��o com aerosol.
Outro passo que adicionamos para reduzir a contamina��o microbial � o de manter as m�os limpas com �lcool e antibi�tico (como � t�pico em cultura de c�lulas).
Note tamb�m que todo o sistema experimental � exposto a luz UV durante a noite antes do experimento.
Com essas medidas, mantemos os registros de patch-clamp com alta estabilidade dos controles por at� 3 dias (vide supra).
Para cada experimento, uma pipeta � colocada sobre a membrana externa (outer nuclear membrane, ONM) do envolt�rio nuclear (nuclear envelope, NE) na configura��o de patch-clamp conhecida como nucleus-attached.
[Note que o NE consiste de duas membranas separadas por uma cisterna: a ONM e a inner nuclear membrane ou INM].
O n�cleo nessas condi��es mant�m sua capacidade de transcri��o e transporte macromolecular, TMM.
O sistema consistente de n�cleos e TTT � capaz de expressar EGFP quando transfetado com pEGFP-C1 (Bustamante et al., 2000a-c).
Para considerar o circuito el�trico equivalente do nucleus-attached, basta observar que o n�mero de NPCs na �rea do envolt�rio nuclear fora da �rea coberta pela pipeta (o patch), � muito maior que o n�mero de NPCs no patch.
Por isso, a �rea fora do patch � eletricamente transparente (sua resist�ncia el�trica � muito menor que a resist�ncia do patch) e o patch � realmente sujeito a um campo el�trico que � o resultado da diferen�a da voltagem entre o eletrodo no interior da pipeta e o eletrodo na solu��o da c�mara experimental (ver Bustamante, 1992).
Caso os NPCs fiquem entupidos com macromol�culas (p.ex., devido a uma alta atividade de importa��o de pDNA ou exporta��o de mRNA), ent�o a voltagem nuclear tem que ser medida e adicionada.
Isto � poss�vel vendo a voltagem de invers�o (reversal potential) para a corrente registrada ou perfurando o envolt�rio (com su��o dentro da pipeta) e medindo a voltagem no momento de ruptura (somente feito em poucos experimentos com fins de confirma��o do outro procedimento).
Este � um procedimento padr�o neste campo (ver Bustamante, 1992).
O registro da corrente de patch � realizado mediante um EPC-7 (List-Medical � temos � ver Contrapartida).
O EPC-7 � conectado a um sistema de aquisi��o de dados (TL-100, Axon Instruments) e interligado e comandado com o software pClamp (Axon Instruments).
Mas, antes de ser digitalizado, o sinal do EPC-7 � condicionado pelo Cyberamp 320 (Axon Instruments).
Isto � necess�rio para otimizar o intervalo de digitaliza��o.
Isto �, uma digitaliza��o de 16-bit n�o adianta se o sinal n�o cobre o intervalo de voltagem para o qual o digitalizador (analog-to-digital converter) � desenhado.
Por exemplo, se o intervalo � �10 a +10 Volts, para poder usar todos os n�veis de digitaliza��o (16-bit em nosso exemplo), o sinal dever� cobrir esses valores.
Para isso � que serve o condicionador de sinal (ver Bustamante, 1988).
7.2.3 Protocolos e an�lise usando o contador molecular Coulter Controle.
Efeito da voltagem.
O crescente reconhecimento de que a voltagem influencia a transloca��o de DNA (p.ex., Szab� et al., 1997; Han & Craighead, 1999) sugere que nossa identifica��o da inativa��o induzida pela voltagem (Bustamante, 1992) pode ser indica��o do entupimento do canal por macromol�culas que s�o for�adas para dentro do canal com o incremento do campo el�trico atrav�s do poro quando � aplicada uma voltagem (similar ao modelo de ball-and-chain para o canal cl�ssico de Na Equa��es b�sicas. Realizaremos inicialmente um tratamento unidimensional. � importante para estabelecer a din�mica de transloca��o, estabelecer a rela��o entre a for�a do campo el�trico, F, e a velocidade de transloca��o, v.
Ou seja, aplicaremos uma segunda lei de Newton geral: F=d(mv)/dt=m(dv/dt)=ma= md2s/dt
7.2.4 Microscopia de fluoresc�ncia dos n�cleos isolados vivos
Usaremos filtros/cubos dicr�icos para a fam�lia EGFP (Omega Optical � temos).
Como fonte de ilumina��o usaremos nossa fonte estabilizada Oriel (Bustamante et al., 2000a-c).
Um dos fatores que quantificaremos � a concentra��o de
Ca
7.2.5 Protocolos e an�lise da fluoresc�ncia
Controle.
6. Refer�ncias bibliogr�ficas
Caracter�sticas do Transporte Passivo e Ativo. Usaremos uma s�rie de sondas FITC-dextran (Sigma Chem, temos) para determinar o di�metro passivo do poro (ver Bustamante et al., 2000a,b). As sondas que passem por difus�o simples ter�o que obedecer a lei de Fick para indicar que n�o temos intera��o dentro do poro e as mudan�as de intensidade de fluoresc�ncia dever� seguir processos de primeira ordem (i.e., exponenciais simples). Para a determina��o da capacidade de transporte macromolecular, usaremos a B-ficoeritrina (BPE, Molecular Probes, temos) conjugada ao NLS do SV40-large T antigen (Sigma). Os n�cleos de mi�citos j� foram testados com �xito por n�s com estas sondas (p.ex., Bustamante et al., 1995a, 2000a,b). Apesar de n�o ser obviamente um processo de difus�o simples, pode acontecer que a cin�tica de transloca��o seja represent�vel por um processo de primeira ordem.
Efeito de
Ca2+.
Como indicamos, alteraremos
[Ca2+]
fora e dentro da cisterna do envolt�rio nuclear para determinar os efeitos sobre a transloca��o controle de DNA.
A altera��o fora da cisterna � feita simplesmente variando a concentra��o extranuclear.
A altera��o dentro da cisterna � feita de duas formas. (1) Com diazo-AM encaixotado (Mol Probes) que � colocado dentro da cisterna.
O diazo � um scavenger de
Ca2+.
Assim, quando liberado por pulso de raio UV (dados com nosso laser de pulso UV de 3 nanosegundos),
[Ca2+]
diminui.
A curta dura��o do pulso permite a redu��o calibrada de
[Ca2+]
com diazo.
(2) Com cADP-ribose-encaixotada (Mol Probes) colocada no banho do n�cleo.
O cADP-ribose � um dos est�mulos mais fortes para a libera��o de
Ca2+
da cisterna.
Assim, quando liberado o estimulante,
[Ca2+]
diminui.
Esperamos uma resposta incremental da TE com satura��o.
Ou seja, o
Ca2+
ajudar� a transloca��o de pDNA de uma forma matem�tica direta.
Em correspond�ncia ao demonstrado recentemente por n�s (Bustamante et al., 2000a), antecipamos que o
Ca2+
fora da cisterna tenha efeito indireto. Isto �, atrav�s de seu efeito de fonte de fornecimento de
Ca2+
na cisterna j� que ele � usado pelas bombas de
Ca2+
nas duas membranas do envolt�rio para recuperar o n�vel normal de
Ca2+
na cisterna.
Transfec��o vs. Sistemas de Sinaliza��o Celular: CREB, PKC, I
7.3.1 Movimenta��o dos sinais monitorados
Usaremos est�mulos que s�o conhecidos por sua influ�ncia sobre os sinais monitorados: choque t�rmico, radia��o UV, ativa��o e inibi��o de quinases (financiamento interno para n�o ultrapassar limite do or�amento) que influem diretamente as cascatas de sinaliza��o, etc. Dado as limita��es financeiras, estamos procurando por algumas subst�ncias que podamos usar. Assim como for poss�vel, usaremos outras subst�ncias n�o mencionadas nesta descri��o.
Mencionamos que a transloca��o e que, a resultante altera��o dos n�veis de concentra��o ser�o analisados inicialmente com aproxima��o de primeira ordem.
Modelos mais complexos poder�o ser desenvolvidos ulteriormente.
A movimenta��o dos fatores de sinaliza��o poder� apresentar complica��es em seu modelagem.
Por isso, � dif�cil antecipar o modelo espec�fico que pode ser usado para tal prop�sito.
Giovannardi et al., 1994;
O'Malley, 1994;
Meyer et al., 1995;
Stehno-Bittel et al., 1995b;
Gerasimenko et al., 1996;
Brown et al., 1997;
Genka et al., 1999
Hern�ndez-Cruz et al., 1990;
Al-Mohanna et al., 1994;
Himpens et al., 1994a,
1994b;
Gerasimenko et al., 1995,
1996;
Bkaily et al., 1996;
Kono et al., 1996;
Tanaka et al., 1996;
Lui et al., 1998a, 1998b;
Pauly et al., 2000;
Genka et al., 2000;
Abrenica & Gilchrist, 2000
Greber & Gerace, 1995;
Perez-Terzic et al., 1996,
1997;
Oberleithner, 1999;
Rakowska et al., 1998;
Str�bing & Clapham, 1999 (separata aqui);
Stoffler et al., 1999
(clique com o bot�o da direita
aqui para acessar a publica��o;
Perez-Terzic et al., 1999;
Keminer & Peters, 1999;
Wang & Clapham, 1999;
Bustamante et al., 1999;
Ribbeck & Gorlich, 2001
Um laborat�rio de EM publicou uma reconstru��o 3D do NPC que sugere a exist�ncia de 8 canais difusionais que s�o perif�ricos ao canal central do NPC
(Hinshaw et al., 1992).
Essas observa��es ainda n�o foram confirmadas.
Nosso colega Mazzanti elaborou uma hip�tese que inclui esses canais ou similares
(Mazzanti, 1998).
Essa idea foi contemplada por outros colegas
Danker et al. (1999) para poder explicar as observa��es indiretas com um m�todo antigo para medir corrente atrav�s do n�cleo (revisado em
Danker & Oberleithner, 2000).
Essa id�ia precisa demonstrar que tem bom selo na mesma prepara��o.
Isso pode ser feito com sondas fluorescentes.
Estudos de microscopia de fluoresc�ncia demonstraram recentemente que esses canais n�o existem
Keminer & Peters, 1999.
Argumentos electrofisiol�gicos j� forma publicados (Bustamante & Varanda, 1998).
Experimentos de biologia celular demonstrando o papel dos NPCs como barrera foram publicados (Ribbeck & Gorlich, 2001).
Para mais informa��o sobre o t�pico, por favor, clique Q&A's.
Mak & Foskett, 1994;
Stehno-Bittel et al., 1995a;
Guihard et al., 1997;
Mak et al., 1999
Nota 1: Receptores de IP
Matzke et al., 1990,
1992;
Mazzanti et al., 1990,
1991,
1994;
Innocenti & Mazzanti, 1993;
Tabares et al., 1991;
Maruyama et al., 1995;
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Draguhn et al., 1997;
Longin et al., 1997;
Tonini et al., 1999
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Tonini et al., 2000;
Franco-Obregon et al., 2000;
Guihard et al., 2000
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1992;
1995;
1996;
1998a;
1998b;
Sabirov et al., 1992;
Vodyanoy & Bezrukov, 1992;
Carneiro et al., 1997;
Cruickshank et al., 1997;
Ternovsky et al., 1997;
Merzlyak et al., 1999
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1998; Hanss et al., 1998;
Akeson et al., 1999;
Lubensky & Nelson, 1999;
Meller et al., 1999
Antes de 2001:
Bustamante, 1994b;
Bustamante et al., 1994c;
Matzke & Matzke, 1996;
Stehno-Bittel et al., 1996;
Perez-Terzic et al., 1997;
Bustamante & Varanda, 1998 (HTML or Malviya & Rogue, 1998;
Lee et al., 1998;
Petersen et al., 1998;
Verkhratsky & Petersen, 1998;
Stoffler et al., 1999;
Rogue & Malviya, 1999 (full text);
Bezrukov, 2000;
Danker & Oberleithner, 2000;
Kiseleva et al., 2000;
Apartir de 2001:
Mazzanti, Bustamante & Oberleithner, 2001 (clique na capa abaixo para ver o trabalho)
Refer�ncias escolhidas sobre NPCs, NE, e n�cleo celular
Microscopia de fluoresc�ncia mostrando pouco gradiente nucleocitoplasm�tico de concentra��o i�nica
Microscopia de fluoresc�ncia mostrando alto gradiente nucleocitoplasm�tico de concentra��o i�nica
Microscopia de luminesc�ncia mostrando pouco gradiente i�nico
Microscopia de luminesc�ncia mostrando alto gradiente i�nico
O Tamp�o do NPC e sua rela��o com ATP e
Ca
2+
da cisterna do NE
Bloqueio do Canal i�nico pelo anticorpo monoclonal mAb414 ao NPC
O Mito dos Canais Perif�ricos ao Canal Central do NPC
Canais Sens�veis ao IP3
e � Rianodina
E, vejamos algumas id�ias fascinantes sobre a contamina��o da NE com ER
Canais de NE que podem ser NPCs, podem estar relacionados aos NPCs ou conectados aos NPCs
Canais de NE Diferentes aos NPCs
Medi��o do Di�metro do NPC com Patch-Clamp
Medi��o El�trica do Di�metro de Outros Canais
Miosina e Actina como Mecanismos de Gating do NPC
Microelectrodos
Estrutura do NPC
Transloca��o de �cidos Nucl�icos
Revis�es
Nossas Principais Publica��es Sobre o Tema (excluindo resumos)
2002
2001
2000a,
b
1998
1996
1995a,
b,
c
1994a,
b,
c
1993a
1992a
Ferramentas �teis
Refer�ncias de PubMed sobre NPCs nos �ltimos 30 dias.
Revis�es de PubMed Sobre NPCs nos �ltimos 5 Anos
Busca de Publica��es com PubMed-Medline - EUA
